生物技術(shù)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用-閱讀頁
2025-01-23 02:25本頁面
【正文】 球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進(jìn)行凍存。 ? 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。 ? RIA（ 放射免疫性鑒定）用于可溶性抗原、細(xì)胞 McAb的檢測。 ? IFA（免疫熒光分析）用于細(xì)胞和病毒 McAb的檢測。 酶聯(lián)免疫吸附測定 ELISA IndirectELISA操作過程 ? 包被抗原 (Ag) 每孔 100微升 ， 每樣品兩次重復(fù) ， 以碳酸緩沖液為空白對照 ， 設(shè)正負(fù)對照 。 ? 抗原稀釋液 為 ： 1L蒸餾水中加Na2CO3 ， NaHCO3 ， NaN3 。 IndirectELISA操作過程 ? 加抗血清（ As） 100微升 /孔， 37℃ 1 小時，用上述方法沖洗。 ? 酶標(biāo)物稀釋液： pH PBST，一般稀釋倍數(shù)為 1： 800或 1： 1000或 1： 1200，事先可用底物標(biāo)定，選擇合適的酶濃度。 ? 底物液配制 （ 現(xiàn)用現(xiàn)配 ） ： （ 無水枸櫞酸 ） ， (12個水磷酸氫二鈉 )，distilled water ， 即為 100ml 酸 — 枸櫞酸 （ 檸檬酸 ） 緩沖液 。 注意配制底物的整個過程需在避光下進(jìn)行 。 ? 用酶聯(lián)儀測 490nm下的 OD值。 使模板 DNA充分解鏈 ? 52℃ 退火 45s，使引物分別連接到 3’端和 5’端 ? 72 ℃ 延伸 30s，在 TaqDNA聚合酶作用下， DNA鏈延伸 ? 45個循環(huán)后，將獲得大量目的 DNA片斷 ? 終延伸 72℃7min PCR PCR產(chǎn)物的電泳檢測 影響 PCR擴(kuò)增結(jié)果的因素 ? 模板 DNA濃度 ? 引物濃度 ? dNTP濃度 ? Mg 2+濃度 ? TaqDNA聚合酶濃度 ? 模板 DNA濃度對擴(kuò)增的影響 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M： DL2022marker； 19： DNA用量 10ng、 20ng、 30ng、 50ng、 100ng、 200ng、 300ng、 400ng、 500ng ? Mg2+濃度對擴(kuò)增的影響 M 1 2 3 4 5 6 7 M： DL2022marker； 17： Mg2+濃度 、 1mM、 、 2mM、 3mM、 4mM、5mM ? dNTP濃度對擴(kuò)增的影響 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M： DL2022marker； 19： dNTP濃度 、 、 、 、 、 ? TagDNA聚合酶濃度對擴(kuò)增的影響 M 1 2 3 4 5 6 7 M： DL2022marker； 17 ： Tag DNA聚合酶濃度 、 1U、 、 2U、 3U、 4U、 5U
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