【正文】 lable analogues 3–8, which failed to induce the hallmarks of methuosis in culture U251 GBM cells.因?yàn)樾枰狹IPP的濃度≥10μM才能有效誘導(dǎo)methuosis，所以我們開始組裝MIPP相關(guān)化合物庫，并與經(jīng)效能提高的確定的目標(biāo)類似物進(jìn)行初步特區(qū)的比較。當(dāng)在U251 GBM細(xì)胞中添加濃度為10μm時(shí)，后者沒有觸發(fā)細(xì)胞空泡化。具體來說，化合物1（有效）與化合物7（無效）的比較表明吡啶環(huán)的重要性，因?yàn)楫?dāng)用段 甲氧基苯基環(huán)化合物來代替它時(shí)呈現(xiàn)無效。α，β不飽和酮的核心基礎(chǔ)類似物可以由吲哚3 carboxaldehydes和芳酮的ClaisenSchmidt縮合制備。這些化合物按照三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)與濃度為10μM的MIPP進(jìn)行了活性比較：（1）在24和48 h借助相差顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞的形態(tài)空泡評估。后添加新鮮化合物。這一分析結(jié)果（見表1）表明，第一個(gè)吡啶環(huán)的氮取向是其是否具有活性的一個(gè)關(guān)鍵特征。相比之下，去除MIPP吲哚環(huán)（化合物12）2 甲基，雖減少但并未消除活性。C, 61 and 95% for 15 and 21, respectively. (C) POCl3, DMF, 0 176。 piperidine, CH3OH, reflux, 89%. (D) NaH, CH3I, DMF, RT, 82%.Table 1. Summary of SAR Studies Performed on MIPP (Compound 2) and Related Compounds Generated in Schemes 1 and 2Table * Results are expressed as percent of controls that received vehicle alone (DMSO). Values are the mean 177。5 甲氧基化合物13，反過來用BBr3甲基化形成5OH的化合物15（圖1B）。但當(dāng)在集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)方面比較時(shí),化合物13和14的活性類似MIPP。為了確認(rèn)吡啶氮的位置仍然是5 甲氧基取代的化合物活性的關(guān)鍵，類似物16和17被分析。因?yàn)楸容^化合物1215與MIPP表明吲哚環(huán)5位和2位的改變都會影響活性，我們從市售2 甲基5 甲氧基吲哚出發(fā)合成了2 甲基5 甲氧基類似物。無論是在MTT法的可行性分析還是在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，這種化合物的抑制活性超過MIPP（見表1）。因此，比較化合物13，19和20后，我們明白當(dāng)吲哚2位分別被H和甲基占用時(shí)，其取得最佳的活性。在生理?xiàng)l件下使用MIPP的局限性之一是其在水溶液中始終有一定溶解度。因?yàn)槲覀円郧暗腟AR研究表明，吲哚環(huán)的5位基團(tuán)有一定隨機(jī)性（比較化合物13和14），所以我們設(shè)計(jì)了一個(gè)14的類似物，增加了電荷和吲哚2位上的一個(gè)甲基。然而，我們有些詫異，沒有明顯的產(chǎn)品，可以由21直接烷基化生產(chǎn)。我們在所有的反應(yīng)中對在吡啶氮發(fā)生的烷基化反應(yīng)進(jìn)行了觀察。單被烷基化產(chǎn)品的產(chǎn)量在5吲哚的地位是微不足道的。市售的2 甲基5 甲氧基吲哚被BBr3甲基化產(chǎn)生22。（16）經(jīng)過POCl3/DMF的甲酰化處理，中間體24和25被獨(dú)立制備。4 乙酰吡啶的縮合產(chǎn)生了相應(yīng)的產(chǎn)物227。Scheme 2. Analogues with 5′ Modifications of the Indole Ring Generated by Functionalizing the Indole Prior to Introduction of the Pyridine MoietyaaConditions and reagents: Compound 22: BBr3, CH2Cl2, ?78 176。C。C。此后，我們將3 （5 甲氧基2 甲基1H吲哚3 基）1 （4 吡啶基）2丙烯1這種化合物縮寫為“MOMIPP”。圖2A顯示的是藥物對細(xì)胞活力的影響的劑量反應(yīng)曲線。為了獲得對每個(gè)化合物的活性持續(xù)比較的方法，5，或10μM的化合物處理下培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量（圖2B）進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法來評估它們對細(xì)胞的生長和生存的影響。在這些條件下，MOMIPP顯??然在減少細(xì)胞的生長和降低細(xì)胞活性方面比MIPP更有效。與此相反，用MIPP處理的細(xì)胞最初在第1天和第2天經(jīng)歷過空泡階段，卻表現(xiàn)出恢復(fù)趨勢，（圖3A）。當(dāng)用集落形成實(shí)驗(yàn)來評估細(xì)胞增殖能力和長期活力時(shí)，MOMIPP和MIPP的區(qū)別就表現(xiàn)非常明顯（圖4）。如果處理被縮短到4小時(shí)，MOMIPP還是較MIPP有效，但都需要更高的濃度以減少集落形成（圖4B）。SD) from four separate wells, with the results expressed as percent of the mean of the parallel control wells. (B) U251 cells seeded in parallel 35 mm dishes were treated with MOMIPP (●), MIPP (■), or an equivalent volume of DMSO (▲), and cells were harvested for counting on each of three consecutive days. Each point is a mean 177。SD) from three separate dishes, with the results expressed as percent of the mean of the parallel control dishes containing DMSO. (B) The effects MOMIPP (●) and MIPP (■) on colony formation were pared as in panel A, except that cells were exposed to the pounds for only 4 h instead of 48 h.為了確定誘導(dǎo)methuosis的化合物針對抗TMZ的神經(jīng)母細(xì)胞瘤是否有效，我們使用以前生成的基本上不受濃度高達(dá)100微米TMZ影響的抗TMZ膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（10）（圖5A）如圖5b所示，MIPP和MOMIPP能夠誘導(dǎo)methuosis和降低抗TMZ細(xì)胞的細(xì)胞活性，但MOMIPP的效能明顯優(yōu)于MIPP。例如，我們觀察到類似情況，MOMIPP在親代和抗阿霉素的MCF7乳腺癌細(xì)胞（圖5C，D）引起空泡并導(dǎo)致其集落形成能力的降低。圖5E所示，在加入MOMIPP后24小時(shí)內(nèi)HMECs進(jìn)行大范圍的細(xì)胞質(zhì)空泡化。為了進(jìn)一步評估MOMIPP對正常細(xì)胞的影響，我們把化合物應(yīng)用到人體皮膚成纖維細(xì)胞。與HMECs類似，接種在合適密度來保持指數(shù)增長的正常成纖維細(xì)胞在接觸到MOMIPP 48小時(shí)時(shí)，表現(xiàn)出生存能力下降40％的特點(diǎn)。這些觀察表明，雖然MOMIPP會對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，但與癌癥細(xì)胞系，如U251和MCF7相比，正常細(xì)胞對這類化合物相對不太敏感。 Figure 5. MOMIPP effectively inhibits the viability of drugresistant GBM and breast cancer cells. (A) TMZresistant U251 glioblastoma cells (U251TR) were derived as described previously.(10) The graph, reprinted from ref 10 with permission, shows that in contrast to the parental U251 cells, the viability of U251TR cells is not reduced by treatment with TMZ. (B) The U251TR cells were treated with the indicated concentrations of MIPP or MOMIPP for 48 h and then subjected to colonyforming assays as described in the Experimental Section. Each point is based on colony counts from three dishes (mean 177。 S