【正文】 細菌的生長測定方法 計數(shù)法 ?直接計數(shù)法 —— 借助顯微鏡 ?間接計數(shù)法 —— 平板計數(shù) 生長量測定法 ?測定重量、體積、含氮量來反映細菌的生長 第五頁，共六十八頁。 ②濾膜染色法：一定量樣品過濾到濾膜上，然后染色計數(shù)。 第六頁，共六十八頁。 第八頁，共六十八頁。 數(shù)了 80個小格中有 120個細菌 ， 樣品中的細菌濃度是多少 ？ (120個 247。 數(shù)數(shù)細菌〔或其他微生物或細胞〕數(shù)目，〔一般數(shù) 16 5=80個小格〕，折算樣品細菌濃度； 第十頁，共六十八頁。 ? 需要知道濾液的體積和濾膜的面積。 第十一頁，共六十八頁?！蔡攸c：不要求記體積〕 第十二頁，共六十八頁。6diamidino2phenylindole,dihydrochloride 4,6二 脒 基 2苯基 吲哚 DNA 2Cl H2N +NH2 C N H H2N C NH2 Measurement of total cell counts 全細胞染色法〔死活不分〕： DAPI染色， DTAF DAPI:無毒性熒光染料，能夠與 DAN雙鏈強力結(jié)合并產(chǎn)生熒光。 第十三頁，共六十八頁。 有必要區(qū)分細菌的死活嗎？ ? 飲用水中衛(wèi)生細菌學標準是 TBC100個 /mL〔平板計數(shù)的標準〕，如果我們采用染色顯微鏡檢測技術對剛剛加氯消毒的飲用水進行檢測，可能會發(fā)現(xiàn)細菌數(shù)量會遠遠超過 100個 /mL，是不是飲用水就是不合格的飲用水呢？ 第十五頁，共六十八頁。 吖啶橙〔 AO〕染色直接計數(shù)〔 AODC〕 ? 吖啶橙染色直接計數(shù)法〔 AODC〕：水樣采集后迅速參加甲醛固定，甲醛最終濃度 2%；取 10mL固定后水樣參加 %吖啶橙〔 Acridine Orange， Sigma公司〕染色 1~2min.；將染色水樣經(jīng)濾膜〔孔徑 ，直徑 25mm，黑色聚碳酸脂濾膜， Nuclepore公司〕過濾；過濾后將濾膜置于載玻片上，用落射熒光顯微鏡〔日本 Nikon， EFD型〕計數(shù)視野中發(fā)橙色或綠色熒光的菌體；顯微鏡光源為 200W汞燈，激發(fā)光濾光片為 450~490nm，光束別離濾光片 510nm，阻擋濾光片 520nm。 BacLight染色直接計數(shù)法 (一種核酸探針 ) ? BacLight染色直接計數(shù)法：將試劑按照產(chǎn)品要求配制后，取 2mL固定后水樣參加 60181。所用濾光片波段同AODC相同。 BacLight 第十八頁，共六十八頁。視野中長大或變粗的菌體被認為是活菌。 CTC染色直接計數(shù) —— 活菌計數(shù) ? 將 %的 CTC參加 10mL水樣中〔 CTC最終濃度 1mM〕，避光室溫培養(yǎng) 4h，然后 2%甲醛固定，再按照 AODC法直接鏡檢計數(shù)視野中的紅色菌體。 雙重染色 10181。 rRNA 核糖體核酸 Oligonucleotide probe核酸探針 Fluorescence FISH〔熒光原位雜交法〕 Fluorescence In situ hybridization 16sRNA的堿基組成 — 設計特異的探針〔 probe〕 第二十二頁，共六十八頁。 10181。 間接計數(shù)法 —— 一種活菌計數(shù)法 ①平板計數(shù)法： 描述： CFU〔 colony formation unit〕 /mL 將一定體積的菌液，均勻涂布在固體培養(yǎng)基上〔例如水中細菌總數(shù)采用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基〕，一定溫度下培養(yǎng)，計數(shù)平板形成的菌落，一個菌落代表一個細菌。 第二十五頁，共六十八頁。 ?稀釋平板計數(shù)法 — 固體培養(yǎng)法 菌樣被無菌水不同稀釋倍率后平板培養(yǎng)圖 第二十七頁，共六十八頁。 10 2 10 3 10 4 10 5 各取 1ml， 均勻涂布于冷固體培養(yǎng)基平板上或與溫熱液態(tài)固體培養(yǎng)基混合冷卻 。 第二十九頁，共六十八頁。 ? 注意：作空白及取平行樣 〔 2～ 3組 〕 均值減小誤差 第三十頁，共六十八頁。 間接計數(shù)法 —— 一種活菌計數(shù)法 ②濾膜法：過濾到濾膜上〔把膜放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)〕，然后把濾膜貼到培養(yǎng)基上，細菌獲得營養(yǎng)而生長，形成菌落。 間接計數(shù)法 —— 一種活菌計數(shù)法 ③液體計數(shù)法〔 MPN法， most probable number法〕最可能數(shù)法 特點：液體培養(yǎng)、統(tǒng)計學查表計數(shù) 主要用于不能在平板培養(yǎng)基上形成菌落的菌 〔硝化菌、反硝化菌、硫酸復原菌〕 將菌接種于液體培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，采用一定的技術來檢測是否有細菌生長。 第三十三頁，共六十八頁。 (4)統(tǒng)計－查表－計算 ? ①統(tǒng)計數(shù)量指標確實定 ? 根據(jù)不同稀釋度變黑試管，得到三位數(shù)及其中最低稀釋度 ? 取重復管數(shù)都有菌生長的最高稀釋度的生長管數(shù)，為數(shù)量指標的第一位數(shù)字，后面兩個稀釋度的生長管數(shù)后兩位數(shù)提問：上例情況而言統(tǒng)計數(shù)量是幾？ ? 320 104 第三十五頁，共六十八頁。 上面例子中數(shù)量指標“ 320〞 對應的細菌最可能數(shù)為 /毫升， 最低稀釋度為 104，折算出樣品中菌濃度為 104個菌 /毫升。 〔二〕 測生長量法 〔 1〕測體積：粗放的方法，離心或自然沉降后觀察體積； 〔 2〕測細胞干重：離心法、過濾法兩種； 105~110186。C 、 2h、馬福爐 第三十七頁，共六十八頁。 ①制標準曲線〔 OD~No〕 ② 測菌液濁度，查