pcv2-orf-表達(dá)-在線瀏覽
2024-09-14 08:55本頁(yè)面
【正文】 ot可見(jiàn)有特異性條帶產(chǎn)生，獲得了理想的純化效果，表達(dá)的重組蛋白能被PCV2的單克隆抗體所識(shí)別。 gene expression1. 病毒培養(yǎng)將PCV2接種于PKl5細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h，用D葡萄糖于37℃處理15min，再培養(yǎng)72h，將培養(yǎng)病毒的細(xì)胞反復(fù)凍融3次，收集的病毒液．70℃保存?zhèn)溆?。引物合成后稀釋?5pmol/μL，分裝后保存于20℃。分相： Eppendorf中，加入等體積的Tris飽和酚，充分振蕩混勻，12000rpm離心，15min； Eppendorf 中，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)充分混勻，12000rpm離心15min；用酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)重復(fù)抽提一次，沉淀DNA； Eppendorf中，加入等體積異丙醇，液氮中放置3min，12000rpm離心15min。溶解： 用30181。4. 目的片段的PCR擴(kuò)增以全病毒基因?yàn)槟０澹捎?0181。L， dNTPs ，10Mg2+ free buffer 181。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共30循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。1％瓊脂糖凝膠的配制：稱取3g瓊脂糖，加入300mL lTAE溶液，微波爐加熱至完全溶解。電泳槽內(nèi)倒入足夠的lTAE溶液，使之正好沒(méi)過(guò)制好的瓊脂面。L與3181。 PCR的回收在l％的瓊脂糖凝膠上電泳完P(guān)CR產(chǎn)物后，將膠置于紫外燈下，迅速切下含DNA的瓊脂糖塊，使膠塊盡可能小，：按每100mg瓊脂糖加入300181。L W1液，12000rpm，離心15s，棄去收集管中的液體，再次加入500181。L TI液靜置l min，離心l min，將回收的DNA溶液儲(chǔ)存于20℃?zhèn)溆?。pMD18T Vector l 181。LBuffer 5181。L反應(yīng)體系，混勻，4℃過(guò)夜連接。 感受態(tài)細(xì)胞的制備 a 從20℃ 冰柜中取出凍存的菌種，在LB培養(yǎng)基平板上劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；b 從37℃過(guò)夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落，接種到3mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；c 取30181。 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a 取15181。L感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；b 快速轉(zhuǎn)移至42℃水浴中熱激90s，立即冰浴3min；c 加入600181。L LB液體培養(yǎng)基重新懸浮。6. 重組質(zhì)粒pET32aORF2的構(gòu)建 目的片段與pET32a表達(dá)載體的雙酶切及回收將純化回收PCR產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒分別用BamH I、Hind III雙酶切，37℃酶切過(guò)夜。LHind III 5181。LPET32a酶切質(zhì)粒 80181。L反應(yīng)體系，37℃過(guò)夜酶切。用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并用l％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收結(jié)果。反應(yīng)體系和條件如下：(pMDORFs) insert DNA 4181。LLigase 10Buffer 1181。L共10181。 轉(zhuǎn)化和鑒定取連接產(chǎn)物5uL轉(zhuǎn)化入100181。挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定。將酶切和PCR鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為
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