細(xì)胞總rna提取及逆轉(zhuǎn)錄-在線瀏覽
2025-06-18 08:08本頁面
【正文】 S: 18S=1874nt ?第一步： 提取小鼠肝臟組織的 RNA 二、 RNA提取的注意事項(xiàng) RNA酶 ：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實(shí)驗(yàn)器材表面。 盡量避免 外 源性 RNase 污染 A. 操作環(huán)境空氣潔凈。 B. 用新開封的化學(xué)試劑。 D. 玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過去 RNase 處理。 抑制 內(nèi) 源性 RNase 活性： RNase 抑制劑 。 1) 發(fā)放口罩 、 帽子 、 手套 ， 每個組來一個人領(lǐng)取 。 2) 實(shí)驗(yàn)教師操作 : 取新鮮小鼠肝臟組織 ， 組織塊不宜過大 ,放在玻片上立即研磨 ,研磨要徹底 。 使組織細(xì)胞 充分裂解 。 4)室溫孵育 10 min。 特點(diǎn)：需低溫操作，但價格經(jīng)濟(jì)。 mRNA提取試劑盒 真核細(xì)胞 mRNA的 3末端有 ploy(A)尾，利用寡聚 dT纖維素結(jié)合 mRNA，將其從細(xì)胞總 RNA中分離出來。 有效濃度： %%(DEPC水 )，室溫磁力攪拌 20分鐘。 滅活條件：高壓。 試劑的配制 :無 RNase的溶液 (用 DEPC水配制 , 高壓 ) 儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。 肝素 ： 使用濃度： — 10mg/ml 效 果 : 37 ?C 時，可抑制 95%的 RNase活力。 5)加入 200 ?l氯仿 ， 震蕩混勻 2030s， 室溫放置 5min（此期間液體開始 分層 ，此時不要輕易攪動液體 ）。 RNA (清澈透明 ) DNA Protein 7) 將清澈透明的 上 層水相 轉(zhuǎn)移至另一離心管中。 10000rpm， 離心 10min。 ９ ) 加 1ml 75%乙醇 洗滌管壁。 再離心幾秒鐘 ， 將管壁液體 （ 用加樣器 ） 完全移凈 。 當(dāng) RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在 冰上 操作，操作要迅速。 （ 干燥的時間由 RNA沉淀大小決定 ） （ 干燥后的沉淀應(yīng)該是 無色膠樣透明狀 ， 沉淀要充分干燥但避免過分干燥 ， 此步驟非常關(guān)鍵 ） 注意事項(xiàng) ： RNA: 避免放在 37 ?C孵箱中過度干燥以防無法溶解。 判斷 RNA沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 溶解的 RNA應(yīng)置冰上保存 。 15) 剩余 9 ?l溶液放到冰上備用 （將用于 RT－ PCR）。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響 RNA的溶解。 逆轉(zhuǎn)錄酶： 存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。 以 mRNA為模板的 DNA聚合酶，形成與 RNA堿基相互補(bǔ)DNA鏈，后者稱為互補(bǔ) DNA－cDNA。 ?第二步：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) AAAAAA(n) mR
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