基因的體外重組和轉(zhuǎn)化-在線瀏覽
2025-06-16 05:53本頁面
【正文】 連接后的重組分子還能被這兩種限制酶切割么？ ？ ? 若均不是以上情況呢？ 二、平末端的連接 平末端連接 (blunt end ligation)： 在 T4DNA連接酶的作用下，將兩個具有平末端的雙鏈 DNA分子連接成雜種 DNA分子。端各加上一段寡聚核苷酸 , 制成人工粘性末端 , 然后在 DNA連接酶的作用下 , 連接成為重組的 DNA。 ?DNA接頭法： DNA接頭（ adapter） 是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 （ 1）在引物上添加酶切位點 ?。∽⒁? ① 添加保護序列 ? Primer1: 539。 利用嗜熱聚合酶如 Taq聚合酶的模板非依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性 (在 70～ 75℃ 活性高 )，使PCR產(chǎn)物的 3′ 末端加一個 A的粘性端，將其直接克隆至 3′ 粘性末端含一個 T的線性克隆載體中 . Taq 酶 PCR擴增 + 連接 轉(zhuǎn)化 藍白篩選 目的片段 ?T載體的構(gòu)建： ? 用限制性內(nèi)切酶如 XcmI, HphI, 與 MobII 酶切產(chǎn)生 3‘末端未配對的 T； ? 應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶與雙脫氧 TTP加入一個突出的 T殘基到線形化載體的 3’末端。 五、 Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng) Gateway技術(shù)： 一種克隆操作平臺：把目的基因克隆到入門載體（ Entry Vector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（ Destination Vector，目的載體）上。 第二節(jié)、重組體導入細菌細胞 ? 轉(zhuǎn)化 (transformation):受體細胞捕獲并表達質(zhì)粒 DNA的生命過程； ? 轉(zhuǎn)染 (transfection):受體細胞捕獲并表達噬菌體 DNA的生命過程； ? 轉(zhuǎn)導 (transduction):重組體包裝成噬菌體導入受體細胞的過程。 一、大腸桿菌感受態(tài)的制備 感受態(tài)： 細胞處于能攝入核酸分子時的生理狀態(tài)就稱為感受態(tài)。此后不久， Cohen等人用 CaCl2法實現(xiàn)了質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細胞，操作原理如下： ?將處于對數(shù)生長期的細菌置入 0℃ 的 CaC
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