【正文】 普遍用作指示劑。指示劑一般加在電泳上樣緩沖液中，為了使樣品能沉人膠孔，還要加入適量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。溴乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。通常，／m1的EB，這樣在電泳過程中可以隨時觀察核酸的遷移情況，這種方法適用于一般性的核酸監(jiān)測。[注意]：EB有潛在的致癌危險，操作時必須戴乳膠手套或一次性手套。(2)瓊脂糖。(4)DNA分子量參照物（marker）。(6)10溴酚藍(lán)上樣緩沖液。(2) 加熱或沸水浴后使瓊脂糖溶解。(4) 將瓊脂糖溶液倒人模具，～，檢查有無氣泡。(5) 連接電泳槽與電泳儀之間的電源線，正極為紅色，負(fù)極為黑色。(7) 加入1TAE電泳緩沖液至電泳槽中，液面高于膠面1mm，小心取出梳子。(9) 用移液器將DNA樣品加入梳孔中。電壓選擇為3～5V／cm。(11)根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否終止電泳；切斷電源后，含EB的凝膠可以直接于紫外線燈下觀察結(jié)果或拍照記錄。以無DNA的TE為空白，測定樣品在260nm和280nm波長下的光密度吸收值，每個樣品重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。3 根據(jù)雙鏈DNA 1 OD260nm=50mg，計算出樣品DNA的濃度，計算公式為所測的OD260nm 50/10（mg/ml）附錄一、核酸換算數(shù)據(jù) dsDNA10kb=180。106 Dalton1 OD260nm=40mgRNA10kb=180。實驗原理：通過PCR的方法擴(kuò)增目的基因片斷的過程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片斷通常需要通過TA克隆的方法，重組到T載體中，通過序列測定清楚DNA序列。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進(jìn)行加A的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。pMD 18T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning) 的專用載體。在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的Xba I 和Sal I 識別位點(diǎn)之間插入了EcoR V 識別位點(diǎn)，用EcoR V 進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的339。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的339。本制品是以最為常用的pUC18載體為基礎(chǔ)研制而成，所以它具有同pUC18載體完全相同的功能。另外，本制品中還含有Control Insert (500 bp)，可用于Control反應(yīng)。對克隆后的PCR產(chǎn)物用M13 Primers進(jìn)行DNA測序。宿主具有編碼β半乳糖苷酶的C端基因。由α互補(bǔ)形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用Xgal顯色測定出來，它能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和藍(lán)色底物。實驗內(nèi)容：試劑 pMD 18T Vector試劑盒，或自己PCR擴(kuò)增回收純化的片段，T4DNA鏈接酶。 200mg/ml的IPTG 過濾除菌 20mg/ml的X—gal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。* ml進(jìn)行實驗也可得到滿意的結(jié)果。2. 16℃反應(yīng)30分鐘 (過夜反應(yīng)也不影響連接效率)。4. 在含有40ml 20mg/ml的XGal、4ml 200mg/ml 的IPTG、50100mg/ml Amp的L瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。5. 挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)T載體中插入片段的長度大小。2. 在進(jìn)行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2 ~ 10。3. 克隆時使用的Insert DNA片段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會影響TA克隆的效率。當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA用量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。6. 連接效率偏低時，可適當(dāng)延長連接時間至數(shù)小時。相關(guān)問題怎樣提高pMD18T Vector的克隆效率?1. 純化PCR產(chǎn)物。3. DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會影響克隆效率。 PCR產(chǎn)物難以插入載體，為什么?1. 確認(rèn)PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的339。有些DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平端, 如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005) 等擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物不能直接用于TA克??；PCR產(chǎn)物保存時間不要過長, 長時間保存的PCR產(chǎn)物會脫去末端的A堿基。3. 確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。5. 確認(rèn)抗生素的濃度是否過大。轉(zhuǎn)化后的菌落全為藍(lán)色 (或淡藍(lán)色)，為什么?插入的PCR片段較短（小于500 bp)，且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時，平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色。因此，用于pUC18載體測序的引物都可以使用。實驗原理 通過冰冷的CaCl2溶液處理大腸桿菌，細(xì)菌處于0℃、CaCl2低滲液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，使之處于短暫的“感受態(tài)”，在這期間，細(xì)菌能夠攝取各種不同的外源DNA片段或基因，使受體細(xì)胞獲得供體基因的某些性狀，質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化是重組DNA技術(shù)中重要的一環(huán)。 通過化學(xué)方法，可人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，最經(jīng)典的是CaCl2法（1972年），其原理是細(xì)菌處于0℃、CaCl2低滲液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA與鈣離子結(jié)合形成抗DNase的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物；通過在豐富培養(yǎng)基中恢復(fù)1h左右，球狀細(xì)胞復(fù)原，轉(zhuǎn)化子中的抗性基因得以表達(dá)；隨后將菌液涂布于含抗生素的選擇性培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子可分裂、增殖，形成菌落。Ca2+處理的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)105～106個轉(zhuǎn)化子／μg環(huán)化DNA。轉(zhuǎn)化時菌濃度應(yīng)控制在不超過107／ml。③化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其他二價金屬離子(如Mn2+，CO2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化率提高100～1000倍。同時，開環(huán)狀質(zhì)粒只有超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率的75％，線型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率更要低100～1000倍，線型轉(zhuǎn)化率低是因菌體中核酸外切酶將進(jìn)入的線型DNA降解的原因?？紤]到質(zhì)粒DNA在recA+菌中存在與細(xì)菌染色體DNA整合的可能，因而，通常在轉(zhuǎn)化實驗中都選用recA—菌株作為宿主菌。 2．重組質(zhì)粒 pNTEGFP。 4．氨芐青霉素(100mg／m1)，用無菌水配制并過濾()除菌，濾液于20℃冰箱中保存。 6．含抗生素LB平板 配方同上，高壓消毒后，冷卻至65℃左右，加入氨芐青霉素，終濃度為50～100μg／m1培養(yǎng)液，加入抗生素后立即倒平板。操作步驟1. 將DH5a細(xì)菌接種在LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。 3． ，接種于50 ml新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)OD600=；4℃10min,然后4℃ 4000r／min離心8min，棄去上清液。 5．沉淀的菌體再懸浮于2m1 ／L冷CaCl2溶液，并置于冰浴中。 8．42℃熱沖擊90s后，立即放入冰浴,放置2－5分鐘。 10．37℃劇烈振搖培養(yǎng)60min。以上操作均需在無菌條件下進(jìn)行。次日觀察各平板上菌落生長情況，并算出轉(zhuǎn)化率即每微克DNA能轉(zhuǎn)化多少個細(xì)菌。 2．制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴低溫操作，同時注意無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。4．菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率?！舅伎碱}】？如何提高轉(zhuǎn)化率？？ 實驗六 PCR擴(kuò)增基因特異片段實驗?zāi)康模? 學(xué)習(xí)PCR體外擴(kuò)增的原理及其引物設(shè)計原則；了解擴(kuò)增過程中各因素對擴(kuò)增結(jié)果的影響；掌握PCR的基本操作。在分子生物學(xué)研究中，廣泛地應(yīng)用于研究基因突變，獲取加上酶切位點(diǎn)的目的基因和DNA序列測定等方面，是分子生物學(xué)中一項極為常用的技術(shù)。兩個引物分別位于靶序列的兩端，同兩條模板的3＇端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。由于每一循環(huán)的產(chǎn)物都可作為下一循環(huán)反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級方式增加。 (一)PCR引物設(shè)計 1．Tm值 Tm值是PCR引物設(shè)計中的一個重要參數(shù)，是指引物與模板之間精確互補(bǔ)并且在模板過量的情況下有50％的引物與模板配對，而另外50％的引物處于解離狀態(tài)時的溫度，Tm值一般高于55℃。最常用的Taq酶的最適溫度(TE)范圍為70～74℃，根據(jù)TE可以先確定一個合適的退火溫度范圍(Ta)。這是因為如果退火溫度低于酶的最適反應(yīng)溫度時，酶的合成反應(yīng)會非常緩慢，但片面考慮提高溫度又會造成引物脫落而不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 2．引物的長度 引物長度一般在15～30個核苷酸之間比較合適。引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶的最適反應(yīng)溫度，還使合成引物的費(fèi)用大大增加。 3．引物的GC％含量 引物的GC比最好設(shè)計在40％～60％的范圍內(nèi)。如上所述，Tm值的估計可簡單地根據(jù)經(jīng)驗式Tm＝4GC+2AT+℃獲得。即當(dāng)引物3′末端為A時，即使有錯配堿基也最不易延伸，所以引物設(shè)計時可將3′末端設(shè)計為A，以提高復(fù)制精確性?？偠灾?，引物的3′末端不要考慮使用T。 6．二引物自身之間不能配對 二引物自身不能配對是指同一對引物之間不能有配對的多個堿基，特別是在引物的3′末端。一般引物自身配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不大于3，兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個。能同時達(dá)到最佳退火溫度，將會影響PCR擴(kuò)增效果。 (二)PCR反應(yīng)條件 1．PCR緩沖液 常用的1PCR緩沖液為10mmol／L TrisHCl (常溫)，50mmol／L KCl，／L MgCl2。 (1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對PCR反應(yīng)影響很大，因為[Mg2+]與引物模板及產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成、產(chǎn)物的忠實性、酶活力、產(chǎn)物的產(chǎn)量等諸多因素有關(guān)。 (2)dNTP：常用dNTP濃度為20μmol／L(可用范圍為20～200μmol／L)?？梢员籘aq酶接受的經(jīng)過修飾的dNTP有以下幾類：dig11dUTP、5—bromodUTP、biotin11—dUTP、biotin16—dUTP、7—deazadGTP和次黃嘌呤。 (3)K+離子濃度：PCR反應(yīng)中K+離子的作用是促進(jìn)Taq酶活力與促進(jìn)引物退火，一般使用濃度是50mmol／L，但當(dāng)K+離子濃度高于50mmol／L時會抑制Taq酶活力。TrisHCL緩沖系統(tǒng)的特點(diǎn)是具有很高的溫度系數(shù)(／℃)，20℃℃延伸反應(yīng)時，實際pH值降低至7．2。 (5)保護(hù)劑：由于PCR反應(yīng)體系中蛋白的含量極低，所以加人的酶非常容易變性，通常需加入一定量的保護(hù)劑。加入保護(hù)劑對PCR循環(huán)數(shù)較多的擴(kuò)增反應(yīng)效果尤其明顯。模板可以是基因組DNA或純化的質(zhì)粒DNA，當(dāng)然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。小于100ng的哺乳動物細(xì)胞基因組DNA(相當(dāng)于約104個細(xì)胞)，經(jīng)30個循環(huán)，10％的反應(yīng)物應(yīng)能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產(chǎn)物帶。3．引物濃度 ～／L。 4．PCR反應(yīng)中的酶 Taq酶最早是從水生嗜熱菌(thermus aquaticus)中分離得到的，該酶的最適溫度是72℃，在94℃時相當(dāng)穩(wěn)定，半衰期長達(dá)38min。實驗內(nèi)容儀器和試劑1．儀器 PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀等。2. ，按下列順序加樣，建立20μl反應(yīng)體系。94℃變性3min，94℃45秒，64℃ 1分鐘，72℃3分鐘，20個循環(huán)。）5 . 取5μl PCR反應(yīng)液及1μl上樣緩沖液混合，進(jìn)行瓊脂糖電泳(5V／cm)，選擇適當(dāng)大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。注意事項，因此，在進(jìn)行PCR前，模板的純化和引物設(shè)計尤為重要?！舅伎碱}】1. PCR的原理是什么？2. PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作用？3. PCR中怎樣預(yù)防出現(xiàn)假陽性結(jié)果？ 4. 什么是Tm值？有何用途？如何計算？ 5. 引物設(shè)計應(yīng)遵循什么原則？ 6. 你會使用哪種引物設(shè)計軟件？實驗七 DNA片段的回收及純化實驗?zāi)康? 了解瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA片段的常用方法，掌握根據(jù)實際情況選用方法的原則，并用試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物DNA片段?；厥諏嶒炛袃蓚€最重要的技術(shù)指標(biāo)是產(chǎn)物的純度與回收率：純度未達(dá)標(biāo)時會嚴(yán)重影響以后的酶切、連接、標(biāo)記等酶參與的反應(yīng)；回收率不理想時往往會大大增加前期工作量。低熔點(diǎn)膠在30℃時凝結(jié)、65℃時熔化，這一溫度尚不足以使DNA分子變性。割下的膠加入TE后于65℃保溫促使凝膠熔化，再加入等體積的酚抽提去除凝膠。 2．玻璃粉(乳)法 將膠條割下加入NaI溶液浸泡，劇烈振蕩數(shù)分鐘促使溶膠。離心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保溫，洗脫吸附于玻璃粉上DNA，再次離心收集含DNA的上清液即可。 3．QIAgen膠回收試劑盒 由于凝膠溶于含NaI的溶膠液，DNA能專一地與離心柱中纖維素結(jié)合。 4 其他試劑盒，本實驗采用的是北京塞百盛生物技術(shù)公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒。此法簡便快捷，可在幾分鐘內(nèi)從PCR反應(yīng)液，或十幾分鐘內(nèi)從普通瓊脂糖凝膠中回收高純度的PCR產(chǎn)物，用于DNA測序及其它酶促反應(yīng)。該系統(tǒng)不僅用于純化PCR產(chǎn)物，還可以從反應(yīng)液或普通瓊脂糖凝膠中回收各種類型的DNA片段，適用范圍從150bp到十幾kb。l反應(yīng)體系）在1%的普通瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的DNA條帶裝入2ml離心管中。l 8