rt-pcr實(shí)驗(yàn)心得-在線瀏覽
2024-10-24 05:32本頁面
【正文】 后 , 搖晃試管使其均勻 ,在稍離心 ,放于冰盒上 .反應(yīng)也在冰上操作 . 2 PCR 儀預(yù)熱到 50176。建立 25ul 的反應(yīng)體系 。 4 RNA 的量宜大 2ug/reaction! 5 要有要有逆轉(zhuǎn)錄 (50℃ ,30min)和初始熱活化 (95℃ , 15 min)。CTGCACCACCAACTGCTTAG339。TGAAGTCAGAGGAGACCACC339。 bcl2:(+)539。//()539。 擴(kuò)增片段長度為 319bp。 ■ 電泳 1 電泳緩沖液 : TBE:工作緩沖液 TBE,我的是 10TBE 的濃縮液 , 100ml 的 10TBE 的濃縮液加入 1900 的三蒸水 ,既是為 . 6緩沖液上樣緩沖液 (4℃ 保存 ) ■ % / %:瓊脂糖凝膠的配制及用法 : 找干凈的容積大約為 100ml 的瓶子 ,加瓊脂糖 再加 50ml 電泳緩沖液(或 :+100ml 電泳緩沖液 )，微波爐中火 60 秒至沸騰，取出 ,熔化的瓊脂物冷卻 ,用 1ml 的移液槍 ,取瓊脂糖凝膠封底后將溫?zé)岬哪z倒入 已置好梳子的膠膜中 ，在室溫下放置 3045min 后現(xiàn)進(jìn)行電泳 。滴 /泡沾緩沖液 )。 先取出凝膠盒 ,放側(cè)板和梳子 ,在封底凝固后 ,到入凝膠 ,跑電泳時(shí)在取梳和側(cè)板 ,此時(shí)凝膠和電泳液相混 !注意不要有氣泡 ! ) ■ PCR 產(chǎn)物電泳 取 目的基因 RTPCR產(chǎn)物 各 10μl及 內(nèi)參 RTPCR產(chǎn)物 各 5μl加已點(diǎn)在紙上的 (只要干凈即可 !)溴酸蘭 (即 6緩沖液上樣緩沖液 )量大約 12ul(量宜大不宜小 ,否則難以下沉 )，反復(fù)吸打混勻 (操作時(shí)注意事項(xiàng) :不要有氣泡 ,關(guān)鍵是不要壓槍到頭 !)用移液槍滴加到小槽內(nèi) (操作的注意事項(xiàng) ,伸入液面下 ,但不要碰到膠 !) 后進(jìn)行電泳 ! Maker 的不加 ,直接移液槍滴加到小槽內(nèi) . ■ SYBR ■ SYBRGreen I 染色方法 1 配制 : 用 PH 的緩沖液（如： TAE， TBE 或 TE），按照 10000： 1的比例稀釋 SYBR GreenⅠ 濃縮液，混勻，制成染色溶液。室溫振蕩染色 1030 分鐘，染色時(shí)間因凝膠濃度和厚度而定。 ■ 實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備 預(yù)防 RNA 酶污染 : * 全程佩戴一次性手套。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防 微生物污染。例如，使用 RNA 探針的實(shí)驗(yàn)室可能用 RNA 酶 A 或T1 來降低濾紙上的背景，因而某
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