【正文】 ；商品酶制劑；消耗品（如反應(yīng)管，吸頭）和實(shí)驗(yàn)設(shè)備（如加樣器、離心機(jī)）。通常，測(cè)定分析階段的每一步都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。測(cè)定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來(lái)自非病人標(biāo)本來(lái)源的核酸。如果沒(méi)有例外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，即使平行的污染質(zhì)控中僅有一管顯示出有PCR片段污染。對(duì)于所有的擴(kuò)增技術(shù)，由于圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。反應(yīng)孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，循環(huán)儀的溫度控制和加熱塊中熱傳導(dǎo)的一致性必須有常規(guī)的檢查以避免假陰性結(jié)果。3）RNA的降解。2）RT或熱穩(wěn)定聚合酶的抑制物（如酚、血紅素）。下述因素通常影響cDNA合成的效率：l）RT活性的降低或完全缺乏。2．6靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增2．cDNA合成為RTPCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的 cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈。實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。RT－PCR測(cè)定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前來(lái)經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的污染。需注意的是；液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。當(dāng)標(biāo)本為疾時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理。如在 HBVDNA PCR測(cè)定中。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致。用 GIT（：穩(wěn)定化處理的 RNA標(biāo)本在室溫可保存 7天，如貯存時(shí)間較長(zhǎng)，則RNA測(cè)定敏感性略有下降。用于RNA測(cè)定的核酸樣本應(yīng)在緩沖液中一80 C或液氮中貯存。2．4．標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清／血漿等可于70 下長(zhǎng)時(shí)間貯存。通常應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。如用于 DNA提取的含 EDTA的全血標(biāo)本及用于 RNA提取的經(jīng) GITC 穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。如標(biāo)本不能及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室，最好選用 GITC處理方法以穩(wěn)定標(biāo)本。在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。GITC可使RNAse不可逆失活的適合濃度為5mol/L。由于RNA易于降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本的穩(wěn)定化處理有時(shí)是必不可少的，Chaotropic物質(zhì)[特別是異硫氨酸抓鹽（Guanidine thiocyanate，GITC）]可使DNAse和RNAse立即失活。如未作抗凝處理，則物血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除肝素。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。RNA酶的主要來(lái)源是實(shí)驗(yàn)人員的手。采樣者采樣時(shí)起碼要談．一次性手套。一次性塑料容器使用時(shí)無(wú)需進(jìn)一步預(yù)處理。2．1．標(biāo)本的采集常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。擴(kuò)增嚴(yán)物的分析在本區(qū)進(jìn)行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置：（l）核酸擴(kuò)增僅三（2）微量加樣器（覆蓋1～1000 μl）；（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。本區(qū)儀器設(shè)備自己置：（l）4冰箱、－20 或70 冰柜三（2）高達(dá)臺(tái)式冷凍離心機(jī)；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量如排器若干支（覆蓋l～1000μl）；（6）專用工作服和工作鞋；（7）專用辦公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（9）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）；（10）超凈工作臺(tái)；（11）超聲波水?。ㄌ幚泶蠓肿覦NA適用）。RNA測(cè)定時(shí)的單鍵。心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（8）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。1．l．試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)本區(qū)用于貯存溶液的制條、溶液的分裝和主反應(yīng)混合液的制各。不同的工作區(qū)必須使用不同的工作服，可以不同的顏色來(lái)區(qū)別。與上述特定實(shí)驗(yàn)區(qū)有關(guān)的各個(gè)房間必須有明確的標(biāo)記，以避免不同工作區(qū)內(nèi)的設(shè)備物品如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。即1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；2）標(biāo)本制備區(qū)；3）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)和的擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。第一篇：臨床基因擴(kuò)增(PCR)診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范(試行)附件2臨床基因擴(kuò)增（PCR）診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范（試行）為使基因擴(kuò)增診斷技術(shù)規(guī)范有效的用于臨床，保證檢測(cè)質(zhì)量，更好地為臨床疾病的診療服務(wù)，特制定本規(guī)范。1．臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置：和儀器設(shè)備臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為四個(gè)隔開的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備。如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)同時(shí)完成的熒光定量PCR方法或全自動(dòng)分析儀如Cobas－T（Anplicor）等，則3）和4）兩個(gè)區(qū)可合并。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)必須遵循一嚴(yán)格的）順序，只能按單一方向進(jìn)行，即從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)～標(biāo)本制備區(qū)～擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)～擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。此外，當(dāng)工作人員離開各工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。本區(qū)儀器設(shè)備配置：（l）4 冰箱和一20 冰柜；（2）混勻器；（3）微量加樣器若干支（覆蓋1～1000pl）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品；（7）消耗品： 一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。1．2．標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。cDNA合成也在本區(qū)進(jìn)行。1．3．?dāng)U增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)模板材料（來(lái)自標(biāo)本制備區(qū)）和主反應(yīng)混合液（來(lái)自試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)）的加入以及擴(kuò)增反應(yīng)等專門在本二．作區(qū)內(nèi)近行。1．本區(qū)面積應(yīng)為6～8m。本區(qū)儀器設(shè)備配置：視檢測(cè)方法不同而定，如為PCRELISA，則需（l）微量加樣器若干支（覆蓋l～2s（2）酶標(biāo)權(quán)、洗報(bào)機(jī)和恒溫箱。2．臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢測(cè)的所有階段，即測(cè)定分析前的標(biāo)本來(lái)集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。當(dāng)使用非密鬧采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采禪，必須注意防止來(lái)自來(lái)樣者的皮屑或分泌物的污染?？芍貜?fù)使用的玻璃器〔應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ鳎ǔ：胁灰资Щ畹腁NA酶。最好是熱滅菌，250 烘烤 4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。臨床用于RNA（如HCV RNA）測(cè)定的血標(biāo)本最好進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。2．2．標(biāo)本的穩(wěn)定化處DNA分析，標(biāo)本采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室。在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿加入含有GITC的試劑管中進(jìn)行穩(wěn)定化處理。如果GITC濃度小于 4mol／L；RNA會(huì)很快降解。如果溫度低于室溫，GITC即會(huì)結(jié)晶，所以在加入標(biāo)本前應(yīng)使之完全溶解。2．3標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本來(lái)集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。是否冷藏取決于標(biāo)本的用途，較長(zhǎng)時(shí)間在室溫貯存會(huì)導(dǎo)致靈敏度大大降低。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果在未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。用于DNA測(cè)定的核酸樣本應(yīng)在 10mmol／L Tris，lmmol／L EDTA緩沖液（pH 7．5－8．0）中 4 保存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。2．5．標(biāo)本的處理（核酸提?。┖怂崽崛∈菦Q定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟。抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過(guò)程中確．留的有機(jī)溶劑（如酚、氯份等），這些物質(zhì)對(duì)其后的酶反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。采用對(duì)血清杯水煮沸裂解以釋放DNA的方法時(shí)，肉眼觀察不明顯的溶血也會(huì)對(duì)擴(kuò)增測(cè)定有很強(qiáng)的抑制作用，應(yīng)使用正規(guī)的核酸提取方法（如經(jīng)典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。再提取核酸。此外，當(dāng)靶核酸為 RNA時(shí)，降解是一個(gè)主要問(wèn)題。對(duì)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，如果沒(méi)．現(xiàn)RNA降解的證據(jù)。對(duì)于后者，建議常規(guī)使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。為后面擴(kuò)增的模板。必須排除由于酶質(zhì)量不高、試劑降解或加樣錯(cuò)誤而引起的 cDNA合成不充分。當(dāng)RNA明顯為完整而沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)懷疑有此類抑制物。2．6．2影響擴(kuò)增的因素有多種因素可引起PCR的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如抑制劑或酶活性喪失（見上）、遲大溫度不對(duì)、晚十十濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。2．7污染在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：PCR片段的污染（產(chǎn)物污染）三天然基因組DNA的污染；試劑污染（貯存液或工作液）：以及交及污染（如氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。一旦發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止。2．7．l．測(cè)定分析前的污染源。2．7．2．測(cè)定分析階段的污染源。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。污染的來(lái)源之一是許多樣本在同時(shí)制備時(shí)的交及污染，但最主要的污染來(lái)源為以前擴(kuò)增產(chǎn)生的特異產(chǎn)物DNA片段。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取PCR產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定并嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作程序。要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的正是為了預(yù)防污染。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP：從而產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖激酶（UNG），可破壞來(lái)自以前測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對(duì)將要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染。由于上面提到的方法會(huì)給人一種假的安全感，所以不能以其來(lái)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來(lái)非擴(kuò)增的天然 DNA的污染。工作完后必須定期采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。2．8．?dāng)U增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法。但臨床PCR測(cè)定項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對(duì)、對(duì)探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性。相反，提高潤(rùn)度和／或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性。2．9．質(zhì)量控制如上所述，應(yīng)該開展各種質(zhì)控來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)定分析當(dāng)中各步驟的質(zhì)量，如RNA的完整性、對(duì)擴(kuò)增是否合適和敏感。由于PCR測(cè)定的高敏感性，所以試劑的生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備、PCR本身和實(shí)驗(yàn)中的每一步都要求有質(zhì)控。2．9．1．1．與實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備有關(guān)的質(zhì)控?？芍崛〉腄NA是否發(fā)生降解。然而；明顯出現(xiàn)降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內(nèi)）在經(jīng)瓊脂糖凝膠電冰分離和用溴化乙錠染色后也可見有強(qiáng)的熒光信號(hào)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估計(jì)，好的 DNA提取物，A260/A280 比值應(yīng)該在 1． 752．0之間；否則，污染（殘留的蛋白或酚）可能會(huì)很高。最快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點(diǎn)跟DNA分離相