【正文】 是一種熒光染料，能夠插入DNA分子的堿基平面之間，使螺旋松弛，增加浮力密度，同時與核酸分子結(jié)合后，在紫外光激發(fā)下發(fā)出橙色熒光，可以顯示DNA區(qū)帶所處的位置。含有細(xì)胞裂解液的體系在長時間超速離心平衡后，DNA的沉降速度與擴(kuò)散速度達(dá)到平衡，染色體DNA、質(zhì)粒、RNA以及蛋白質(zhì)等，不同浮力密度的物質(zhì)可在管內(nèi)不同位置形成區(qū)帶。然后可用5%CTAB選擇性沉淀DNA，進(jìn)一步用乙醇洗滌、沉淀，保存于TE緩沖液中。即在堿性pH（）下，DNA分子均變性，恢復(fù)中性時，線性染色體DNA由于兩條鏈分開且基因組分子量大，單鏈互相無規(guī)則纏繞，不能準(zhǔn)確復(fù)性，就與其他成分共沉淀，而質(zhì)粒DNA分子小且兩條閉合環(huán)狀分子及時變性也較緊密的纏繞在一起，準(zhǔn)確復(fù)性而留于上清溶液中。質(zhì)粒DNA分離方法有堿裂解法、煮沸法、去污劑（Triton/SDS）裂解法、CsClEB（氯化銫溴乙錠）密度梯度平衡離心法、羥基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法及商業(yè)化的試劑盒等。要點：如果下一步驟中酶反應(yīng)的條件要求嚴(yán)格，最可靠的方法是再用水飽和的乙醚抽提一次，以徹底去除核酸樣品中的痕量酚與氯仿，然后在68℃水浴中放置10分鐘使痕量乙醚蒸發(fā)掉。從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)常用酚/氯仿抽提法，在氯仿中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。 核酸的純化：①首先是去除蛋白質(zhì)。③防止化學(xué)因素(酸堿等)和物理因素(高溫或機(jī)械剪切等)引起核酸變性或破壞。保持核酸的完整性，即保持其天然狀態(tài)。（二）轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控（轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）（1）反式作用因子的活性調(diào)節(jié)；（2）反式作用因子與順式元件的結(jié)合；（3）反式作用因子的組合式調(diào)控作用（三）轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控（1） “加帽”和“加尾”的調(diào)控；（2）mRNA選擇性剪接對表達(dá)的調(diào)控 ；（3）RNA編輯的調(diào)控；（4）mRNA轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)（四）翻譯水平的調(diào)控（1）翻譯起始調(diào)控；（2）mRNA穩(wěn)定性對翻譯的影響 （五）翻譯后水平的調(diào)控（1）信號肽的切除；（2）新生肽鏈的修飾；(3) 肽鏈的剪接與正確折疊第三章1. 核酸分離純化應(yīng)注意哪些事項？一般的分離純化分為哪些步驟？各步的要點是什么？分離純化核酸應(yīng)注意：①應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性，防止降解；②排除其它分子的污染。4. 簡述真核表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)和調(diào)控方式。5．基因組中重復(fù)序列很少5．含有大量重復(fù)順序，這是真核生物基因組的重要特點。4．單順反子結(jié)構(gòu)，即一分子mRNA只能翻譯成一種蛋白質(zhì)。基因組中非編碼的順序所占比例是真核生物與細(xì)菌、病毒的重要區(qū)別。2. 無明顯操縱子結(jié)構(gòu)，存在大量反式作用因子與順式作用元件的相互作用調(diào)節(jié)3．編碼序列在基因組中約占50%編碼順序不重疊，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多為多順反子結(jié)構(gòu)。基因組龐大、復(fù)雜，具有許多復(fù)制起點，每個復(fù)制子大小不一。3. 比較原核基因組與真核基因組的結(jié)構(gòu)與功能特點1原核生物基因組僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成，含有1個復(fù)制起點，無染色體結(jié)構(gòu)，基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一區(qū)域進(jìn)行。當(dāng)葡萄糖濃度低時，會使cAMP濃度升高，形成cAMPCAP復(fù)合物，并與啟動子上游的CAP位點結(jié)合，刺激RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄作用，使轉(zhuǎn)錄效率提高50倍，然而這種作用的前提條件是無阻遏效應(yīng)存在。降解物基因活化蛋白（catabolite gene activation protein，CAP）是一種同二聚體，其分子內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)和cAMP結(jié)合位點。DNaseⅠ超敏位點（hypersensitive site）：染色體DNA中轉(zhuǎn)錄較為活躍的區(qū)域，組蛋白相對缺乏，并對核酸酶（DNaseⅠ）高度敏感，故名。（25）RNA編輯（RNA editing），是一種較為獨特的遺傳信息加工的方式，即轉(zhuǎn)錄后的mRNA在編碼區(qū)發(fā)生核苷酸改變的現(xiàn)象，是在RNA分子上出現(xiàn)的一種修飾現(xiàn)象。由亮氨酸殘基組成的疏水面即為亮氨酸拉鏈條，兩個具有亮氨酸拉鏈條的反式作用因子，能借疏水作用形成二聚體。（22）鋅指（zinc fingers）結(jié)構(gòu)，由約30個氨基酸殘基組成的一段多肽序列，其中 4個氨基酸殘基（兩個是半脫氨酸兩個是組氨酸，或4個都是半脫氨酸）以配位鍵與Zn2+相互結(jié)合，形成指狀結(jié)構(gòu)，常存在于真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。有兩種形式，一種形式是兩個反向排列的拷貝之間隔著一段間隔序列；另一種形式是兩個拷貝反向串聯(lián)在一起，中間沒有間隔序列，這種結(jié)構(gòu)亦稱回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。（19）基因家族（gene family），就是指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。（17）假基因（pseudogene），假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達(dá)或表達(dá)異常，生成無生物活性的多肽。（15）轉(zhuǎn)位因子（transposable　elements）：是指可以從染色體基因組上的位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，甚至在不同的染色體之間躍遷的基因成分。（13）反應(yīng)元件（response elements），是一類能介導(dǎo)基因?qū)?xì)胞外的某種信號產(chǎn)生反應(yīng)的DNA序列，被稱為反應(yīng)元件（response elements）。（11）反式作用因子（transacting elements），可結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子稱為反式作用因子（transacting elements）。（10）順式作用元件（cisacting elements），指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的DNA序列。（9）斷裂基因（split gene），真核生物的結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)的，編碼氨基酸的序列被非編碼序列所打斷，因而被稱為斷裂基因（split gene）。（8）終止子（terminator），在基因3162。（7）順反子(cistron)：基因所對應(yīng)的一段核苷酸序列被稱為順反子（cistron），一個順反子編碼一種完整的多肽鏈。啟動子是基因表達(dá)不可缺少的重要元件。（4）基因組（genome）：細(xì)胞中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總合。（2）hnRNA：真核基因最初轉(zhuǎn)錄生成的RNA ，是mRNA的前體。第二章 1. 名詞解釋（1）順反子(cistron)：基因所對應(yīng)的一段核苷酸序列被稱為順反子（cistron），一個順反子編碼一種完整的多肽鏈。它是遺傳的功能單位。（3）轉(zhuǎn)位因子（transposable　elements）：是指可以從染色體基因組上的位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，甚至在不同的染色體之間躍遷的基因成分。（5）啟動子（promoter）：是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始轉(zhuǎn)錄的序列，其大小不等，具有轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因的mRNA的功能。（6）基因（gene），基因是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。它是遺傳的功能單位。端下游外側(cè)與終止密碼子相鄰的一段非編碼的核苷酸短序列，具有終止轉(zhuǎn)錄的功能，叫做終止子（terminator）。在編碼序列之間的序列稱為內(nèi)含子（intron），被分隔開的編碼序列稱為外顯子（exon）。包括啟動子、上游啟動子元件、增強(qiáng)子、加尾信號和一些反應(yīng)元件等。（12）上游啟動子元件（upstream promoter elements），是TATA盒上游的一些特定的DNA序列，反式作用因子可與這些元件結(jié)合，影響RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。（14）增強(qiáng)子（enhancer），是一段DNA序列，其中含有多個能被反式作用因子識別與結(jié)合的順式作用元件，反應(yīng)作用因子與這些元件結(jié)合后能夠調(diào)控（通常為增強(qiáng)）鄰近基因的轉(zhuǎn)錄。（16）轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn），是一類較大的可移動成分，它是由幾個基因組成的特定的DNA片段，除有關(guān)轉(zhuǎn)座的基因外，至少帶有一個與轉(zhuǎn)座作用無關(guān)并決定宿主性狀的基因（如抗藥性基因）。（18）重疊基因（overlapping genes），或嵌套基因（nested genes），是指基因的核苷酸序列（或閱讀框）是彼此重疊的基因，稱為重疊基因或嵌套基因。（20）反向重復(fù)序列，是指兩個順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。（21）看家基因（housekeeping gene），在幾乎所有細(xì)胞中或發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)的基因，被稱為看家基因。（23）亮氨酸拉鏈（leucine zippers），是指在一段肽鏈中每隔7個氨基酸殘基就有一個亮氨酸殘基，這段肽鏈所形成的α螺旋就會出現(xiàn)一個由亮氨酸殘基組成的疏水面，而另一面則是由親水性氨基酸殘基所構(gòu)成的親水面。（24）基因重排（gene rearangement)，是指某些基因片段改變原來存在順序，通過調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，重新組成為一個完整的轉(zhuǎn)錄單位。（26）分子伴侶（molecular chaperone），是指能幫助新生肽鏈折疊，使之成為成熟蛋白質(zhì)，但本身并不參與共價反應(yīng)的物質(zhì)，大部分為蛋白質(zhì)。2. 簡述乳糖操縱子中CAP的正性調(diào)節(jié)作用機(jī)制。CAP與cAMP結(jié)合形成復(fù)合物才能刺激操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)葡萄糖濃度較高時，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，轉(zhuǎn)錄效率下降，由此可見，乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因的高表達(dá)既需要有誘導(dǎo)劑的存在（消除阻遏效應(yīng)），又要求無葡萄糖或低濃度葡萄糖的條件（促進(jìn)cAMPCAP復(fù)合物的形成，刺激轉(zhuǎn)錄）。1．多條染色體，兩份同源的基因組，而原核生物的基因組則是單拷貝的。2．具有操縱子結(jié)構(gòu)這是原核基因組的一個突出的結(jié)構(gòu)特點。3．非編碼的順序占絕大部分，約占90%以上。4．多順反子結(jié)構(gòu)，無內(nèi)含子，是連續(xù)的，因此轉(zhuǎn)錄后不需要剪切。存在斷裂基因。6．存在移動基因，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子6有基因家族，功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，它們可串聯(lián)在一起，亦可相距很遠(yuǎn)。（一）DNA水平的調(diào)控：（1） 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)的調(diào)控作用，（2）基因修飾，（3） 基因重排，（4）基因擴(kuò)增。為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因為遺傳信息全部貯存在一級結(jié)構(gòu)之內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活力很高，在制取過程中必須防止核酸酶對核酸的降解。制備RNA要特別注意防止核酸酶的作用，因為RNase分布很廣，活力很高；而對DNA更重要的是防止張力剪切作用，因為DNA分子特別長，容易斷裂。要點：從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸，要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提。②用氯仿抽提處理，去除核酸溶液中的痕量酚。2. 質(zhì)粒純化可采用什么方法？簡述各方法基本原理。①堿裂解法基本原理：利用質(zhì)粒較小且為超螺旋共價閉合環(huán)狀分子的特點，它與染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上有很大差異來分離。②煮沸法：利用加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象，變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，通過高速離心（12,000g）將兩者分開。③CsClEB（氯化銫溴乙錠）密度梯度平衡離心法：CsCl是一種大分子量的重金屬鹽，長時間超速離心時，在管中形成1～。RNA可與Cs+結(jié)合，因此密度最大，沉積管底，蛋白質(zhì)漂浮于液面上。區(qū)別不大，但EB易插入線性DNA分子中，從而增大了與閉合環(huán)狀DNA 的密度差，使兩者更好地分離。3. 哪些因素會影響RNA的提取，簡述與DNA提取的不同之處？所有RNA的提取過程中都有五個關(guān)鍵：①樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性解離，釋放出RNA；③對RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離；⑤對于多糖含量高的樣品還要采取措施有效去除多糖雜質(zhì)。DNA提取時在細(xì)胞破碎時加入適量RNA酶以除去混雜的RNA，但若是提取RNA，則從裂解開始就應(yīng)抑制RNA酶活性。在中性pH或堿性緩沖液中，核酸分子骨架上的磷酸基團(tuán)在水中的解離帶有負(fù)電荷，在電場中由負(fù)極向正極遷移。此時核酸分子在電場中的遷移速率受到分子形狀和大小的影響，在均一的凝膠網(wǎng)絡(luò)中，它的遷移速率只與分子的大小相關(guān)，使不同分子量者分開，而相同分子量聚集形成條帶。批號、廠家不同的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同。聚丙烯酰胺凝膠電泳：該凝膠形成的孔徑小，透明，彈性好，無紫外吸收，可用于DNA小分子的分離。？有哪些方法？目的：電泳分離后的DNA片段，經(jīng)確認(rèn)為需要的片段，要從凝膠中回收并純化。？每個循環(huán)包括哪些步驟？有何應(yīng)用價值？PCR反應(yīng)的基本原理：首先是雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈的DNA分子，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補鏈。每一個溫度循環(huán)周期均是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三個步驟組成。？試分析單次PCR是否可實現(xiàn)DNA量的無限增長。單次PCR不會實現(xiàn)DNA量的無限增長，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。Ⅰ？Taq酶有什么不足之處？如何解決？DNA聚合酶Ⅰ有很大的局限性：① 該酶是熱敏感的，在雙鏈模板DNA解