【正文】 基因功能分析技術(shù)和干細(xì)胞全能性因子在爪蛙中的功能研究體系，加上原有的多年從事早期胚胎發(fā)育研究的高水平發(fā)育生物學(xué)家和長期從事細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的高水平細(xì)胞生物學(xué)家，使得這個(gè)團(tuán)隊(duì)可以全方位地開展胚層形成研究。本項(xiàng)目的特色之三是，在人員組成上，既各有專攻，有互為補(bǔ)充。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理方面具有不可替代的優(yōu)勢，可用于闡明基因/蛋白發(fā)揮作用的分子機(jī)理和網(wǎng)絡(luò)。斑馬魚和爪蛙均具有產(chǎn)卵量大、體外受精、胚胎體外發(fā)育的特性，容易觀察胚胎早期的發(fā)育過程，也為未受精卵（卵母細(xì)胞）和受精卵中的基因修飾（如mRNA的過量表達(dá)或抑制）提供了基本條件，因而已成為研究脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的兩個(gè)最常用的模式系統(tǒng)。本項(xiàng)目的特色之一是分別從鑒定參與胚層發(fā)育的新基因和從胚層形成相關(guān)細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞全能性因子入手，以鑒定新基因和新功能為切入點(diǎn)，在很大程度上保證了研究的原創(chuàng)性和新穎性，使整個(gè)研究從一開始就站在了本領(lǐng)域的最前沿。本項(xiàng)目選用脊椎動(dòng)物胚層形成研究中最常用的斑馬魚和爪蛙為模式生物，輔以體外研究系統(tǒng)，利用分子、細(xì)胞、生化、組學(xué)等多種研究手段，希望能揭示親源因子在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育，特別是胚層誘導(dǎo)和分化中的功能和分子機(jī)制?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，胚層的發(fā)育是精卵配子中預(yù)存的親源因子和受精卵合子基因之間互作的結(jié)果，其中親源因子起到了決定性的起始和調(diào)控作用。在研究策略上，我們將充分發(fā)揮這兩種模式生物的特色和技術(shù)優(yōu)勢，特別注意兩種模式動(dòng)物研究系統(tǒng)之間的結(jié)合、胚胎體內(nèi)研究與培養(yǎng)細(xì)胞體外研究之間的結(jié)合、以及不同信號(hào)通路之間的交互作用研究，從而保證研究成果的高質(zhì)量、高水平，在分子機(jī)理上認(rèn)識(shí)胚層誘導(dǎo)和分化、母源合子轉(zhuǎn)換等發(fā)育過程的調(diào)控規(guī)律。在研究它們的生物學(xué)功能方面，將主要開展以下分析：1）利用原位雜交確定它們在胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜；2）將體外合成的野生型mRNA或突變型mRNA注射到胚胎中，觀察其對(duì)胚胎圖式發(fā)育的影響，并檢測相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)的變化；3）合成Morpholino反義寡核苷酸，將其注射到胚胎或爪蛙的卵母細(xì)胞中，使相應(yīng)基因功能被減弱或失活，觀察胚胎發(fā)育異常（檢測形態(tài)和標(biāo)記基因）；4）將一個(gè)基因的mRNA或反義寡核苷酸與相關(guān)信號(hào)通路的其它基因的mRNA或反義寡核苷酸組合注射，探討基因互作關(guān)系，建立相關(guān)發(fā)育途徑的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。另一方面，TGFbeta和Wnt信號(hào)，以及與干細(xì)胞全能性相關(guān)的重要調(diào)控因子大多數(shù)都在早期胚胎發(fā)育、特別是胚層形成中發(fā)揮重要作用，因此我們也計(jì)劃分析TGFbeta和Wnt信號(hào)相關(guān)調(diào)控因子以及干細(xì)胞全能性相關(guān)因子（如Oct4， nanog， Klf4等）在胚層形成中的功能和作用機(jī)制。在鑒定到對(duì)胚層形成有重要影響的父源或母源基因后，我們將根據(jù)其表達(dá)譜、表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)和突變體表型，利用體內(nèi)、體外系統(tǒng)研究其發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)理。抑制父源特異性RNA相對(duì)比較簡單（因?yàn)檫M(jìn)入卵子的特定父源RNA的量極少），將反義寡核苷酸注射到單細(xì)胞受精卵中即可。在爪蛙上，將反義寡核苷酸注射到收集的卵母細(xì)胞中，可以有效地剔除儲(chǔ)存在卵母細(xì)胞中的目標(biāo)mRNA，體外培養(yǎng)2天后(可以使原來已存在的蛋白降解)，再將卵母細(xì)胞回移到處理過的雌蛙輸卵管中，并進(jìn)行自然受精（本項(xiàng)目組成員陶慶華教授實(shí)驗(yàn)室是全世界屈指可數(shù)熟練掌握該方法的團(tuán)隊(duì)）。在反向遺傳分析方面，我們將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和卵母細(xì)胞基因下調(diào)技術(shù)鑒定參與爪蛙胚層形成的母源基因，利用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)（比如deep sequencing）鑒定斑馬魚父源特異性RNA。為了深入闡明有重要功能的母源因子的作用機(jī)理，將利用酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)途徑鑒定其互作因子，再在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中研究其在相關(guān)信號(hào)通路中的作用，獲得的結(jié)果再回到胚胎中進(jìn)行驗(yàn)證。如果雜合體之間配種得到的F2純合體能夠長大到性成熟，雌性個(gè)體因該母源基因被轉(zhuǎn)座子破壞而不能表達(dá)出有功能的蛋白，其產(chǎn)出的卵子中就缺乏該母源基因產(chǎn)物，與野生型或雜合型雄性個(gè)體的精子受精后的胚胎就可能出現(xiàn)胚層誘導(dǎo)和分化等方面的缺陷，稱之為母源突變體。2．技術(shù)路線本項(xiàng)目將利用斑馬魚和爪蛙兩種模式動(dòng)物的優(yōu)勢，采用反向遺傳分析和正向遺傳分析的策略，鑒定與胚層形成相關(guān)的母源和父源因子，然后利用已有的基因表達(dá)、功能和機(jī)制研究技術(shù)手段，探討這些因子在早期發(fā)育中的功能和作用機(jī)制。5）發(fā)表高影響因子文章5－10篇；在國際主流期刊上發(fā)表論文50－80篇。3）了解已知的幾個(gè)多能性因子在胚層形成和分化中與母源胚層決定信號(hào)之間的調(diào)控關(guān)系，探索數(shù)個(gè)母源或父源因子在干細(xì)胞多能性和定向分化中的作用。在五年的實(shí)施過程中，本團(tuán)隊(duì)將圍繞設(shè)定的關(guān)鍵科學(xué)問題，從分析胚層的決定和分化、卵母細(xì)胞及早期卵裂的周期控制以及干細(xì)胞分化潛能的控制等生物學(xué)現(xiàn)象入手，實(shí)現(xiàn)如下目標(biāo)： 1）鑒定一批脊椎動(dòng)物母源因子，明確數(shù)個(gè)因子在早期胚胎胚層誘導(dǎo)和分化中的作用，認(rèn)知中囊胚轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理；發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新的信號(hào)通路或新的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，加深對(duì)早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。項(xiàng)目名稱：重要親源分子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的調(diào)控首席科學(xué)家：孟安明 清華大學(xué)起止年限：依托部門：教育部二、預(yù)期目標(biāo)人類和脊椎動(dòng)物的生命周期起始于受精卵胚胎的早期發(fā)育，對(duì)該過程的深入了解對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育、人類健康和醫(yī)學(xué)、畜禽生產(chǎn)、物種保護(hù)等都有重要的潛在價(jià)值。本項(xiàng)目將穩(wěn)定一支高學(xué)術(shù)水平的研究團(tuán)隊(duì)，充分利用斑馬魚、爪蛙和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系等研究系統(tǒng)的優(yōu)勢和互補(bǔ)性，重點(diǎn)研究母源和父源因子，研究它們在胚胎卵裂、體軸決定、胚層形成、細(xì)胞分化與遷移等過程中的作用，深入了解它們發(fā)揮功能的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而更全面、系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；在相關(guān)領(lǐng)域取得一些理論、方法和技術(shù)突破，促進(jìn)我國基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生殖、代謝、干細(xì)胞相關(guān)疾病等領(lǐng)域的發(fā)展；培養(yǎng)高水平研究人才，形成能夠持續(xù)進(jìn)行創(chuàng)新性研究的能力；促進(jìn)我國發(fā)育生物學(xué)學(xué)科的發(fā)展。2）鑒定一批脊椎動(dòng)物父源特異性RNA，有可能突破性地發(fā)現(xiàn)父源RNA在胚胎早期發(fā)育中的普遍作用和特異性作用及其機(jī)理。4）建立新的母源和父源因子鑒定和功能研究技術(shù)，完善相應(yīng)當(dāng)研究平臺(tái)。6）培養(yǎng)可持續(xù)發(fā)展的學(xué)術(shù)梯隊(duì)：博士后、副研究員1012名；博士生4050名；技術(shù)支持人員810名三、研究方案總體研究方案1．學(xué)術(shù)思想本項(xiàng)目的中心學(xué)術(shù)思想是以斑馬魚和爪蛙為模式生物，輔以哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞研究系統(tǒng)，從分子、細(xì)胞和胚胎整體水平闡述胚胎早期發(fā)育過程中，預(yù)存于卵子和精子中的親源分子在胚層發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制，著力于未知親源分子的鑒定、發(fā)育功能分析、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制分析和對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的新的調(diào)控機(jī)制的探索。在利用正向遺傳學(xué)方法研究斑馬魚母源因子對(duì)胚層誘導(dǎo)和分化的影響方面，我們利用Tol2轉(zhuǎn)座子插入法捕獲母體基因，當(dāng)轉(zhuǎn)座子基因組（含GFP報(bào)告基因）插入到一個(gè)母體基因內(nèi)時(shí)，GFP報(bào)告基因的表達(dá)將受該母體基因啟動(dòng)子的控制，因而在卵母細(xì)胞中可觀察到GFP的存在；通過Tail－PCR、inverted PCR、RACE等方法，可以比較容易地克隆出該母體基因。我們獲得母源突變體之后，將檢測突變體胚胎中各個(gè)胚層的標(biāo)記基因的表達(dá)、Wnt、Nodal、BMP等關(guān)鍵發(fā)育信號(hào)通路的組份的表達(dá)；在突變體中過表達(dá)一些胚層誘導(dǎo)和分化的關(guān)鍵基因如sqt、betacatenin、bmp2b、fgfsox32等,確定它們與突變的母源基因之間的遺傳互作關(guān)系。另一方面，對(duì)于那些在斑馬魚上發(fā)現(xiàn)的有重要功能的母源基因，將在爪蛙胚胎上檢驗(yàn)其功能的保守性。然后設(shè)計(jì)特異性的嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸去抑制相應(yīng)基因的mRNA（或小RNA）的表達(dá)。在斑馬魚上，我們正在建立類似的技術(shù)。對(duì)于注射了反義寡核苷酸的胚胎，將首先從形態(tài)學(xué)上觀察胚胎的胚層變化，然后檢測常用的胚層標(biāo)記基因的表達(dá)，確認(rèn)其可能的作用?？紤]到Wnt和TGFbeta信號(hào)，以及細(xì)胞全能性相關(guān)因子在胚胎早期發(fā)育中起著廣泛而重要的作用，因此鑒定出對(duì)胚層形成有重要影響的親源基因后，將重點(diǎn)研究它們與細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞分化調(diào)控因子的相互作用關(guān)系。在前期工作中，我們已經(jīng)通過酵母雙雜交、染色體免疫沉淀、基因芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多受Wnt和TGFbeta信號(hào)通路調(diào)節(jié)的基因，以及與這兩個(gè)信號(hào)通路上的介導(dǎo)因子或調(diào)節(jié)因子相互結(jié)合的蛋白，在本項(xiàng)目中將重點(diǎn)研究它們在胚胎早期發(fā)育，特別是胚層形成中的功能和對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)理。在研究新基因?qū)π盘?hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)理方面，將主要利用體外的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，分析內(nèi)容主要包括：1）該基因過表達(dá)或被抑制時(shí)對(duì)Wnt和TGFbeta信號(hào)的影響；2）過表達(dá)或被抑制時(shí)對(duì)Wnt和TGFbeta信號(hào)通路中的介導(dǎo)因子或調(diào)節(jié)因子的表達(dá)、修飾或穩(wěn)定性的影響；3）亞細(xì)胞定位及其動(dòng)態(tài)變化；4）功能域的鑒定；5）獲得的機(jī)理在體內(nèi)系統(tǒng)中的驗(yàn)證，希望獲得相應(yīng)的遺傳學(xué)證據(jù)。3．創(chuàng)新點(diǎn)和特色本項(xiàng)目關(guān)注的生物學(xué)問題是胚胎發(fā)育中胚層的誘導(dǎo)和分化，這是所有動(dòng)物發(fā)育過程中的重要階段，是多細(xì)胞生物形成的最原始和最基礎(chǔ)性的事件。但關(guān)于親源因子在胚層形成和分化中的功能研究，受技術(shù)限制，一直是早期胚胎發(fā)育研究中的難點(diǎn)。因此本項(xiàng)目完全能夠產(chǎn)生創(chuàng)新性的研究成果。本項(xiàng)目的特色之二是選擇了合適的研究系統(tǒng)