【正文】 的不完全處理。最可能的原因是增加了6xHis標(biāo)簽（900 Da）和增加到植物源性rhTf的C末端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER保留的信號主題KDEL（600 Da）。加在一起，這些結(jié)果　　表明植物源性rhTf是非糖基化的。相反，在相同條件下，商業(yè)糖化hTf標(biāo)準(zhǔn)和PNGaseF的消化，降低了其分子量至大約73kDa的單帶，這正是期待的hTf的非糖基化成分　。PNGase F能夠去除高甘露醇和復(fù)雜類型N聚糖，除了含有a(1,3)linked的核心海藻糖，一般在植物糖蛋白中發(fā)現(xiàn)（Lerouge et al.,1998）。hTf蛋白包含兩個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)羧基末端區(qū)域（Asn413 and Asn611）（Spik et al., 1975）。對酶的去糖基化，總蛋白提取物以及通過Hispurification 得到的植物源性rhTf的部分純化樣品，用PNGase F處理并通過使用抗hTf抗體的免疫印跡法分析。此外，轉(zhuǎn)基因煙草植物的rhTf有明顯的空間分布的差異，最上面的葉子表現(xiàn)出最高水平轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)積累（數(shù)據(jù)未顯示）。煙葉提取物中rhTf的相對積累量的測定，采用間接的抗hTf抗體ELISA法與一個(gè)hTf標(biāo)準(zhǔn)比較。如圖２ａ，抗ｈＴｆ抗體檢測到一個(gè)明顯的分子質(zhì)量76ｋＤａ的單一蛋白，與ｈＴｆ標(biāo)準(zhǔn)等同尺寸（SigmaAldrich）。轉(zhuǎn)基因植物的rhTf蛋白質(zhì)積累rhTf在轉(zhuǎn)基因植物的積累，通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及其后的使用市面可得的抗hTf抗體的免疫蛋白印跡得到印證。所產(chǎn)生的20多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草株，與所有轉(zhuǎn)基因植物，表現(xiàn)出了正常的生長和發(fā)育，與非轉(zhuǎn)變煙草cv. 81V9相比沒有表型方差。即時(shí)插入上游信號KDEL的6xHis標(biāo)簽整合到ｐＲＪＣ－ｈＴｆ上，以通過固定化金屬親和層析促進(jìn)下游ｒｈＴｆ的純化（ＩＭＡＣ）。來源于煙草蝕刻病毒（ＴＥＡ）ＲＮＡ的５＇端輸出序列和３＇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ＥＲ）保留信號主題ＫＤＥＬ整合入ｐＲＪＣ－ｈＴｆ以最大限度ｒｈＴｆ積累（(Ma et al., 2005。該研究結(jié)果具有重要的影響，其中包括開發(fā)植物源性rhTf作為一種新的靶向給藥系統(tǒng)的可能性，以及未來開發(fā)出基于新的植物源性rhTf治療廣譜疾病方法的可能性。為了驗(yàn)證這個(gè)假說，我們在轉(zhuǎn)基因植物中額外引入了一個(gè)rhTf融合蛋白，包含抗胰高血糖素樣肽1 (GLP1)或其衍生物。這些結(jié)果表明，植物源性rhTf可能存在許多潛在應(yīng)用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的生化和功能特性表明了植物源性ＲＨＴＦ是非糖基化的，正如酶和化學(xué)去糖基化分析證實(shí)的，保留的多項(xiàng)與天然hTf性能相同的性能。因?yàn)樘烊籬Tf是一種分泌分子，rhTf是針對轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)膜系統(tǒng)以提高積累的。此外，可食用的轉(zhuǎn)基因植物組織提供了允許植物源性治療蛋白質(zhì)和多肽直接口服遞送的可能性，消除了昂貴的下游蛋白純化和加工。 Ma et al., 2008）。作為生物反應(yīng)器，植物允許無限的可擴(kuò)展性，通過哺乳動物病原體消除產(chǎn)品污染，以及與微生物或動物相比，使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)降低了生產(chǎn)成本（Daniell,2006。 Daniell, 2006。此外，哺乳動物的細(xì)胞培養(yǎng)很容易受到細(xì)菌和病毒病原的污染，導(dǎo)致產(chǎn)品安全的擔(dān)憂。Sargent et al., 2006）、使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞（ 20毫克?L的細(xì)胞培養(yǎng)）（Ali et al.,1996）和果蠅Ｓ２細(xì)胞（?L的細(xì)胞培養(yǎng)）（Lim et al., 2004）。雖然成功了，但幼倉鼠腎細(xì)胞系統(tǒng)受限于低產(chǎn)量的rhTf（no more than 40 mg? L　of cell culture）。作為一個(gè)可選擇的細(xì)菌生產(chǎn)系統(tǒng)，已證實(shí)rhTf在幼倉鼠腎（ＢＨＫ）細(xì)胞的表達(dá)（Funk et al., 1990。de Smit et al., 1995），隨著19HTF分子內(nèi)二硫鍵的出現(xiàn)，使得利用微生物主機(jī)獲得這種蛋白成為了一項(xiàng)挑戰(zhàn)。描述的RHTF的細(xì)菌表達(dá)，僅允許生產(chǎn)蛋白質(zhì)的氨基末端和羧基末端領(lǐng)域（半分子）（Ikeda et al., 1992。為了使HTF的這些商業(yè)和治療應(yīng)用具備可行性和得到實(shí)現(xiàn)，大量HTF的可靠、廉價(jià)的供應(yīng)是很重要的，取決于一種高效、性價(jià)比合算的重組生產(chǎn)系統(tǒng)。HTF蛋白也有許多巨大的潛在非治療應(yīng)用。近來，HTF被證實(shí)作為一種高效的載體，以送服口服蛋白質(zhì)和氨基酸藥物入內(nèi)臟以實(shí)現(xiàn)全身治療效果（Widera et al.,2004。HTF的治療送遞也降低了放射療法的副作用（Koterov et al., 2003），有助于為骨髓移植患者提供抗微生物活性的作用（von Bonsdorff et al., 2003）。HTF的多功能性可以作為潛在的治療和非治療應(yīng)用。HTF的其他作用包括抵抗細(xì)菌、酵母菌、病毒和真菌的抗菌活性（(Artis et al., 1983。另外，HTF的存在對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)有重要作用，例如體外受精培養(yǎng)（Holst et al., 1990）和肝細(xì)胞群體的維護(hù)和擴(kuò)展（Suzuki et al., 2006）。除其眾所周知的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，hTf還有許多額外的功能，許多與其攜鐵能力無關(guān)。hTf的主要功能是絡(luò)合血中的游離鐵并將之轉(zhuǎn)運(yùn)到全身各處（MacGillivray et al., 1983）。hTf是轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf家族的主要成員。每種TF蛋白包含兩種相似的裂片，分別叫做N末端和C末端，每一裂片包含單一的鐵結(jié)合位點(diǎn)（Aisen and Harris, 1989。簡介轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf包含了所有脊椎動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一系列同源性的鐵結(jié)合蛋白糖蛋白（Aisen and Harris, 1989），主要功能是鐵的螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)。為證明此假說，我們在植物中又額外地表達(dá)了一種包含胰高血糖素樣肽段1（GLP1）或其衍生物的htf融合蛋白。本研究的成功使得未來多領(lǐng)域應(yīng)用植物源性rhtf成為可能。此外，植物源性rhtf保持了許多與天然htf相同的生物活性。本研究中，我們將植物作為獲得重組htf的一種新平臺。其多功能性使其在不同療法和商業(yè)應(yīng)用中有巨大價(jià)值。植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的多功能性概述人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（htf）是人血清中主要的結(jié)合鐵蛋白質(zhì)，在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要作用。另外，htf還有許多其他的作用，包括抗菌功能和對哺乳動物細(xì)胞增殖、分化中的生長因子效用。然而，htf的這些成功應(yīng)用很大程度上取決于大量的高質(zhì)量的htf的應(yīng)用。我們的研究表明轉(zhuǎn)基因植物是一種獲得rhtf的有效系統(tǒng)，%（）。尤其是rhtf在體外可逆性的結(jié)合鐵作用，表明了其抑菌活性、在無血清培養(yǎng)基中的支持細(xì)胞增值的作用，和在體外內(nèi)化進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞的性質(zhì)。植物源性rhtf突出的應(yīng)用就是作為特定細(xì)胞的一種新的載體或者作為蛋白質(zhì)/肽段藥物的口服遞送以治療人類疾病例如糖尿病。在此，我們展示植物源性htfGLP1融合蛋白保持了體外培養(yǎng)基中內(nèi)化進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞的能力。Tf是一種單分子蛋白，分子量范圍為7681 kDa，取決于糖基化程度。 Baker et al., 2002）。hTf蛋白由679個(gè)氨基酸組成，主要在肝臟合成并分泌入血（MacGillivray et al., 1983）。放射示蹤研究顯示至少80%的絡(luò)合至tHf的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至骨髓并組成新生的紅細(xì)胞（Finch and Huebers, 1982）。例如，研究顯示HTF可促進(jìn)體外無血清培養(yǎng)基條件下鼠粒性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的克隆生長（Iizuka and Murphy, 1986）。當(dāng)增殖細(xì)胞高表達(dá)HTF受體以允許HTF包裹并可能引發(fā)和維持細(xì)胞DNA合成時(shí)，HTF常常作為一種生長因子（Gomme et al., 2005）。 Salamah and alObaidi, 1995），降低細(xì)胞粘附的能力（Ardehali et al.,2002）。例如，HTf已被用來治療人類轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥（一種以貧血、鐵超載、生長遲緩和感染發(fā)生率增加為特點(diǎn)的狀況）（Hayashi et al., 1993），局部貧血再灌注損傷（促進(jìn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥、最終因凋亡和壞死而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一種情況）（Hayashi et al., 1993）和心血管疾?。℉ayashi et al., 1993）。此外，HTF已用來作為一種新的載體系統(tǒng)，在體內(nèi)運(yùn)載藥物入癌細(xì)胞（Laske et al., 1997）。 Bai et al., 2005）。例如，許多無血清培養(yǎng)基以HTF作為血清代用品，支持哺乳動物細(xì)胞生長（Barnes and Sato, 1980a,b）。迄今為止，已有數(shù)種表達(dá)系統(tǒng)報(bào)道獲得重組HTF。 Steinlein and Ikeda, 1993。使用細(xì)菌獲得重組ＨＴＦ的進(jìn)一步限制，是其從重組蛋白到獲得功能性產(chǎn)品過程中無法去除信號肽（MacGillivray　et al., 1998）。 Mason　et al., 1991, 1993, 2001）。為了降低生產(chǎn)難度，已研究了數(shù)個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，包括酵母菌（僅在ＨＴＦ的Ｎ－末端領(lǐng)域和兩個(gè)ＨＴｆ突變類型表達(dá)）（Steinlein et al., 1995。因?yàn)檫@些系統(tǒng)都是依靠昂貴的細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵方法，他們不適合低成本的規(guī)?；a(chǎn)。植物生物反應(yīng)器已被證實(shí)作為一種有效的、有吸引力的重組哺乳動物蛋白的生產(chǎn)平臺（Schillberg et al., 2005。Boehm, 2007）。 Boehm, 2007?！∫?yàn)樗麄兊恼婧颂匦裕参锟梢赃M(jìn)行復(fù)