【正文】 來分離。因?yàn)槟z過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強(qiáng)，最后出柱。 2 Sephadex LH20 的原理。將各收集管中的洗脫液分別用 721型分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 540nm 處測(cè)定其光密度。 ：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘 1毫升，進(jìn)行洗脫。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每次清洗液應(yīng)完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，再進(jìn)行下一次洗 滌。打開下端出口，使樣品溶液進(jìn)入凝膠內(nèi)，并開始收集流出液。 ：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關(guān)閉下端出口。再用洗脫液平衡 l至 2 個(gè)柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。將凝膠輕輕攪動(dòng)均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過 l厘米時(shí)，打開下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達(dá)到 8 厘米 ,關(guān)閉出口。 ：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。 (5)葡聚糖凝膠 G25 (SephadexG25) 【實(shí)驗(yàn)操作】 ：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理，稱取 4 克葡聚糖凝膠 G— 25，加 50 毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹 6 小時(shí)，或沸水浴溶脹 2 小時(shí)，一般采用后一種方法。 (3) 藍(lán)色葡聚糖 — 2020 溶液： 稱 取藍(lán)色葡聚糖 — 2020 10毫克，溶于 2 毫升 Tris— 醋酸緩沖液 ()中即成。 【實(shí)驗(yàn)材料】 驗(yàn)器材 層析柱 (120cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶 (帶下口的三角瓶， 250m1)；試管及試管架；量筒 10m1； 721 型分光光度計(jì) (1) Tris— 醋酸緩沖液 ():取 (含 )900ml，用濃醋酸調(diào) pH 至 ，加蒸餾水至 1000m1。 本實(shí)驗(yàn)以葡聚糖凝膠 G— 25 作為固定相載體，來分離藍(lán)色葡聚糖 — 2020 和溴酚藍(lán)。分子量大于允許進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)完全被凝膠排阻，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒 之間流動(dòng)，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可完全進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長(zhǎng)，而最后從層析柱中流出。 可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。 葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑 3— 氯 1， 2— 環(huán)氧 丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。 【實(shí)驗(yàn)原理】 凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。 實(shí)驗(yàn) 五 . 葡聚糖凝膠層析 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 。用 ，然后用蒸餾水洗至中性備用。 (5) 凝膠的再生和回收 凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。據(jù)經(jīng)驗(yàn)， 4或 5號(hào)管核苷酸濃度最大，可作為層析鑒定的樣品液。本實(shí)驗(yàn)洗脫液流出的速度應(yīng)控制在 － 。然后，由柱的上端加水解液 2ml，注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完樣品后，打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容器 2－ 3次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)行洗脫。否則，必須到出重裝，裝好 后，用蒸餾水平衡 2－ 3h 即可加樣品分離。同時(shí)大開下口慢速流出蒸餾水。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲（約 200目尼龍布）墊底或購(gòu)買類似規(guī)格的商品柱。葡聚糖凝膠柱的使用方法： (1) 預(yù)處理 稱取 Sephadex G25（ 50－ 100目）約 5g，加入蒸餾水 100ml，置室溫下 3h進(jìn)行溶脹。 (2) 裝柱 凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為 1:15。然后將柱垂直安裝好，先加入 1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們?cè)谥鶅?nèi)自然沉降。裝柱后的凝膠必須均勻，不能有氣泡或明顯條紋。 (3) 加樣 加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出，直到柱內(nèi)液面與凝膠表面相齊（或留一極薄液層）為止。 (4) 洗脫與收集 洗脫時(shí)，用蒸餾水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行，使凝膠柱上端保持一定的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。洗脫液的收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集 3ml，共收集 10管。但因?qū)游鲋L(zhǎng)度的差異，管號(hào)會(huì)有變化，必要時(shí)可用紫外檢測(cè) A260nm，找出濃度最大的管號(hào)。若使用數(shù)次，就需要再生處理。若實(shí)驗(yàn)完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用 95%乙醇洗兩次，在 60℃烘 箱中烘干，回收保存。 2．學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù) 。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（ Sephadex）和瓊脂糖凝膠（ Sepharose） 。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可 通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密； 交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏 松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。 葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱，各個(gè)組分由于分子量不相同， 在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動(dòng)。若被分離物的分子量介于完全排阻和完全進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達(dá)到分離目的。藍(lán)色葡聚糖 — 2020分子量接近 2 106， 而溴酚藍(lán)分子量為 670，二者分子量相差較大，前者完全排阻，而后者則可完全 進(jìn) 入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時(shí)間不同而分開。 (2) 溴酚藍(lán)溶液：稱取溴酚藍(lán) 10毫克，溶于 5毫升乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，然后逐滴加?Tris— 醋酸緩沖液 ()至溶液呈深藍(lán)色。 (4) 樣品 溶液 ：取溴酚藍(lán)溶液 毫升，藍(lán)色葡聚糖 — 2020 溶液 毫升混勻后為上柱樣品 溶液 。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗 滌幾次，再以緩沖溶液 ( 的 Tris— 醋酸溶液 )洗滌 2— 3 次，使 pH和離子強(qiáng)度達(dá)到平衡，最后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。層析柱中加入洗脫液，打開下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，最后保留約 2厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。裝 柱過程中嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。平衡后，擰緊下端螺旋夾。取溴酚藍(lán)及藍(lán)色葡聚糖 — 2020 混合液 毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動(dòng)層析柱床表面。當(dāng)樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時(shí)，關(guān)閉下端出口。最后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為 3— 4cm。仔細(xì)觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集 3 毫升即換一 支 收集管 (試管預(yù)先編號(hào) )，收集約 20 管左右，樣品即可完全被洗脫下來。 ：將樣品完全洗脫下來后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒 杯中，備用。 Sephadex LH20 的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。如果使用反相溶劑洗脫， Sephadex LH20 對(duì)化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。 3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇－－水系統(tǒng)最為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用100％甲醇沖柱。 4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿－－甲醇），樣品用最少體積的氯仿－－甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。 (1) 選擇條件： 梯度洗脫在 Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。極性在的用甲醇水系統(tǒng) 。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。至少半小時(shí)打開開關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。 (4) 濕法上柱。 (5) 洗脫：控制流速，一般 1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù) 。 再生以備下次使用。 （ 2）柱子盡可能長(zhǎng)， Sephadex LH20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。 （ 3） 餾分一定要接的細(xì)，可 1／ 10，或 1／ 20 個(gè)保留體積接成一餾分。 （ 5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，如不在乎填料者，可用 Sephadex LH20 分鞣質(zhì) （ 6） Sephadex LH20 對(duì)黃酮類成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。 Sephadex LH20 是由葡聚糖 G25 羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。 裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于 Sephadex LH20 而言， 25～ 100μm的粒徑范圍相對(duì)于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。這對(duì)于長(zhǎng)柱（最高至 250cm）而言也是同樣的。 Sephadex LH20 在使用之前必須進(jìn)行溶脹。 在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請(qǐng)參考后頁(yè)之 干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過 。 為確保延長(zhǎng)層析柱的使 用壽命，所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過 質(zhì)。 洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，最大線性流速約 12cm/min（反壓 ），建議流速為 110cm/h。 范文最新推薦 6 工會(huì)黨支部工作總結(jié) [工會(huì)黨支部工作總結(jié) ] xxxx 年，我們工會(huì)黨支部在師直黨工委的正確領(lǐng)導(dǎo)下，認(rèn)真學(xué)習(xí)貫徹 “ 三個(gè)代表 ” 重要 思想，學(xué)習(xí)黨的十六屆四中全會(huì)精神，自覺用 “ 三個(gè)代表 ” 重要思想指導(dǎo)工作，進(jìn)一步加強(qiáng)黨支部的建設(shè)，在工作中較好的發(fā)揮了政治核心和戰(zhàn)斗堡壘作用，工會(huì)黨支部工作總結(jié)。 一、努力加強(qiáng)黨支部的思想建設(shè)、組織建設(shè)和作風(fēng)建設(shè) ：在工會(huì)全體黨員中繼續(xù)深入學(xué)習(xí)鄧小平理論和 “ 三個(gè)代表 ” 的重要思想。堅(jiān)持嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行黨員民主評(píng)議工作，切實(shí)解決黨支部、黨員中存在的問題和不足，努力提高全體黨員的思想認(rèn)識(shí)，為圓滿完成全年的各項(xiàng)工作，提供思想保證。全年共召開民主生活會(huì) 2 次，均取得了良好效果，大家普遍反映心更近了，關(guān)系更融洽了，工作氛圍更加和諧了，團(tuán)隊(duì)的力量更加強(qiáng)大了。支部堅(jiān)持 “ 三會(huì)一課 ” 制度，按時(shí)召開支委會(huì)、支部大會(huì)和黨課學(xué)習(xí)， 堅(jiān)持黨支部委員范文最新推薦 7 經(jīng)常碰頭，有問題及時(shí)研究解決。繼續(xù)認(rèn)真做