【正文】 向太和 ? Taq DNA polymerase： from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus. other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications. 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?Taq DNA聚合酶特性： ?分離 : 1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉。貯備濃度為 510mmol/L，終濃度為 20200 umol/L，分裝 20℃保存。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Primer design Most important!! (1)length: 20～ 30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no plementary sequence (4)3?end of the primer: no modification (5)5?end of the primer:product length， can be modified (6) specificity:less than 70% homology with nonspecific amplification sequence, or 8bp continuous plementary base 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? Primer designed with the help of puter ?DNA database ?conservative region parision, blast ?Primer designed software 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? buffer： ?1050 mmol/L TrisHCl(, 20℃) 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 二 、 PCR技術(shù) 回顧： PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)： ?Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. ?Peoples Choice Reaction 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? The PCR cycle 95oC step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55C to allow the primers to bind, 72oC polymerization step. Mg2+, dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? PCR procedures ?Template (DNA/cDNA), ?primers, ?Taq enzyme, ?10 PCR buffer, with Mg2+, ?dNTPs ?predenaturationdenature pletely ?Denaturation ?annealing ?Elongation ?cycles: 2530 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? PCR reaction ponents and their functions ? template： ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA ?samples： from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. ?DNA： very stable 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? primers If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5‘ends of the primers. Can amplify fragments over 10kb in length Store:純化引物在 25％乙腈溶液中 4℃ ；凍干引物于 20℃ 可保存 12年，液體狀態(tài)于 20℃ 可保存 6個(gè)月。 ? 遺傳材料的基因組 DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生 DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有 可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致 PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 第三節(jié) RAPD和 APPCR 標(biāo)記技術(shù) 主題一、 RAPD標(biāo)記技術(shù) 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 一、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記 (RAPD)的原理 ? RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)： Williams (Du Pont)等于 1990年創(chuàng)立。 ?用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品。 ?某些植物中開發(fā)探針已遍及整個(gè)基因組。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ? RFLP標(biāo)記技術(shù)所用的儀器設(shè)備 ? 雜交箱 ? 紫外交聯(lián)儀 ? 同位素檢測(cè)儀 ? 水浴及搖床 ? 電泳及轉(zhuǎn)膜裝臵 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 三、 RFLP標(biāo)記特點(diǎn) ?優(yōu)點(diǎn)： ?共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型。 ?gDNA探針 : 檢測(cè)的多態(tài)性頻率較高 ， 但不同種屬特異性較強(qiáng) 。 使用磷屏儀，操作更方便。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 —放射自顯影 —數(shù)據(jù)分析 將洗脫好的雜交膜臵于增感屏上 , 于暗室中將 X光片放于雜交膜上， 再放上另一張?jiān)龈衅?，裝人暗袋，并用夾板夾好。封好雜交盒后，臵65℃ 溫箱中振蕩過夜。 ?印跡： 用 10 SSC ， 進(jìn)行 Southern 印跡 ?沖洗： 以 2 SSC 冼膠，風(fēng)干 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 —雜交 —洗脫 ? 預(yù)雜交： 將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、 5 HSB、 DenhardtⅢ ） 中， 封好后臵 65℃ 溫箱中振蕩 5－ 6小時(shí)。 ?變性： mol/L NaOH， mol/L NaCl， 45 min。 ?電泳： %瓊脂糖膠 3060 V電泳 6小時(shí)至過夜。 即：物種的基因組 DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的 DNA作探針，把與被標(biāo)記 DNA相關(guān)的片段檢測(cè)出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。 ? RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是 通過電泳的方法分離和檢測(cè)這些片段 。 ?自從人的 RFLP圖譜構(gòu)建后，已經(jīng)分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的RFLP圖譜。 1980年由 Botstein再次提出。它也是以以 PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。 ? 一類是以 PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如 STS、RAPD、 AFLP、 SSR）等，這類分子標(biāo)記被稱為 第二代分子標(biāo)記 。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 ?第三類是 一些新型的分子標(biāo)記 ，如： ?單核苷酸多態(tài)性（ Single nuleotide polymorphism, 簡(jiǎn)稱 SNP標(biāo)記）； ?表達(dá)序列標(biāo)簽（ Expressed sequences tags, 簡(jiǎn)稱 EST標(biāo)記）等。 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 遺傳標(biāo)記（ geic marker） 具有多型性 易于鑒別 與目標(biāo)基因緊密連鎖 ? 性狀標(biāo)記 色澤， 形態(tài) … ? 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 倒位，易位， G/N/C帶 … ?生化標(biāo)記 同功酶 … ? 分子標(biāo)記 RFLP、 RAPD、 SSR、 AFLP、SNP… … 基礎(chǔ) 基因表達(dá)結(jié)果 表現(xiàn)型 DNA堿基 序列變異 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 三、分子標(biāo)記的種類 ?第一類是以 分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù) ，包括： ?限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（ Restriction fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱 RFLP標(biāo)記）； ?DNA指紋技術(shù)（ DNA Fingerprinting）； ?原位雜交（ in situ hybridization）等。 （ 4） 表現(xiàn)為 “ 中性 ” ， 不影響目標(biāo)性狀的表達(dá) ， 與不良性狀無必然的連鎖 。 （ 2） 多態(tài)性高 ， 自然界存在許多等位變異 ， 無須人為創(chuàng)造 。 它能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的 DNA片段，它直接反映基因組 DNA間的差異。 蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。 ?電泳可區(qū)分 同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化 。催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)組成有所不同的一組酶。 ? 缺點(diǎn)： 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。 ?特點(diǎn)： 直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。 二、遺傳標(biāo)記的 種類 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 ?染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位臵等）和帶型（ C帶、 N帶、 G帶等）。 如穗形、芒長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷 酸多態(tài)性 (SNP)。 ?現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由 Botstein D等 (1980)首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長(zhǎng) 度多態(tài)性 RFLP作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問世 。 ? DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。 ?人類遺傳圖譜包括女性一種配子的 23條染色體 (記作 23，X)和男性兩種配子的 23條染色體 (23 ， X)、 (23， Y)上的所有基因位點(diǎn)?；蚪M內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個(gè)連鎖群。 經(jīng)典遺傳 學(xué)時(shí)代的遺傳連鎖圖譜主要是以家系分析或不同性狀個(gè)體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)同源染色體上 等位基因的變化，通過 計(jì)算重組率 ，確定染色體上基因座位的順序和距離，構(gòu)建基因的連鎖圖譜。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳（ cR），限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為堿基對(duì)，即 DNA的長(zhǎng)度。遺傳圖距單位為厘摩（ cM），每單位厘摩定義為 1％交換率。基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 第 二 章 遺傳圖譜 第一節(jié) 遺傳標(biāo)記概述 基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和 遺傳作圖的標(biāo)