【正文】 段。而現(xiàn)代生物染色技術(shù)的發(fā)展，使更加特異性的核酸染色法與光學(xué)技術(shù)結(jié)合成為可能。SYSMEX XE/XT 系列采用核酸熒光染色后，根據(jù)細(xì)胞成熟度的不同可以體現(xiàn)在其熒光信號(hào)的強(qiáng)弱上，其白細(xì)胞分類通道出正常細(xì)胞分類外，還有兩個(gè)幼稚白細(xì)胞的定量參數(shù)： IG （幼稚粒細(xì)胞）和Other （原始細(xì)胞/ 異常淋巴）。隨著血液分析儀檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，儀器對(duì)于幼稚白細(xì)胞的報(bào)警提示越來越靈敏。b. 幼稚白細(xì)胞分析的應(yīng)用白細(xì)胞中的幼稚成份在臨床上具有顯著意義。試劑中增加了特異性針對(duì)DNA/RNA 染色的熒光染料Polymethine( 聚次甲基染料) 。在最新推出的SYSMEX XE2100 系列、XT2000i/1800i 系列五分類血液分析中，半導(dǎo)體激光作為光源將光束照射在流式細(xì)胞室內(nèi)的白細(xì)胞，通過不同角度的散射光可以反映細(xì)胞外部的體積和內(nèi)部顆粒復(fù)雜程度的信息。二、核酸熒光染色技術(shù)a. 正常五項(xiàng)分類的分析應(yīng)用由于電阻抗原理的局限性，二分群、三分群儀器都無法準(zhǔn)確地檢測(cè)出淋巴、單核、嗜酸性、嗜堿性、嗜中性細(xì)胞。對(duì)于巨大血小板、血小板凝集、小紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片等標(biāo)本，使用傳統(tǒng)的電阻抗原理往往無法準(zhǔn)確測(cè)的，而新的核酸染色技術(shù)結(jié)合光學(xué)流式原理則可以較好地解決。能否采用特殊的方法學(xué)（如核酸染色方法）高靈敏度地測(cè)得幼稚白細(xì)胞的存在，甚至提供定量的參數(shù)，是儀器優(yōu)劣的標(biāo)志之一。對(duì)于紅細(xì)胞系統(tǒng)，幼稚成份主要是網(wǎng)織紅細(xì)胞和有核紅細(xì)胞檢測(cè)，提供定量的參數(shù)甚而可以對(duì)RET 成熟度作進(jìn)一步的分類?；蛘邽榱藴p少這種情況而提**性報(bào)警率（通過降低儀器報(bào)警的閾值），提高了復(fù)片的比例從而造成假陽性率偏高，失去了過篩的意義。對(duì)于外周血中的幼稚成份，過去一般依賴于顯微鏡鏡檢。五分類儀器不同于三分類儀器的主要區(qū)別在于：為了精確定量地檢測(cè)白細(xì)胞的五種成份，各種五分類血液分析儀開始采用多種物理學(xué)原理（電阻抗、光散射、高頻波技術(shù)），甚至設(shè)置專用檢測(cè)通道和化學(xué)染色方法檢測(cè)數(shù)目最少的嗜酸、嗜堿性粒細(xì)胞。該方法可以有效排除難溶性紅細(xì)胞、巨大血小板、血小板聚集及其它非細(xì)胞顆粒等因素對(duì)計(jì)數(shù)的影響，保證嗜堿性粒細(xì)胞及WBC 總數(shù)的精確分類和計(jì)數(shù)。而化學(xué)染色技術(shù)可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的準(zhǔn)確判定。綜合這兩個(gè)角度散射光的信息，結(jié)合其他特殊技術(shù)來完成白細(xì)胞的五分類測(cè)定。~20176。~5176。激光散射分析技術(shù)是五分類法常用的分析技術(shù)，由于細(xì)胞的物理特性，當(dāng)激光照射到細(xì)胞時(shí)，會(huì)有不同角度的散射光出現(xiàn)。儀器通過兩個(gè)通道完成白細(xì)胞分類測(cè)定。具有血液和體液檢測(cè)功能，有六個(gè)通道、九種模式。邁瑞激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)邁瑞（MINDRAY）公司是國(guó)內(nèi)最早有能力生產(chǎn)五分類血細(xì)胞分析儀的廠家，他們目前生產(chǎn)的五分類血細(xì)胞分析儀、BC5800 檢測(cè)速度快：全自動(dòng)進(jìn)樣90個(gè)樣本/小時(shí)，開放進(jìn)樣80個(gè)樣本/小時(shí)型自動(dòng)五分類血液細(xì)胞分析儀，采用半導(dǎo)體激光散射技術(shù)和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，配合改良的流式分析裝置對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行精確的五分類分析。在MAIN 散點(diǎn)圖上（大圖部分）下面散點(diǎn)表示淋巴細(xì)胞群，右側(cè)為粒細(xì)胞群；兩個(gè)小圖，NEEO 為中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖，MOBA 為單核細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞細(xì)胞散點(diǎn)圖。Size 表示血細(xì)胞的大小、Complexity 表示白細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度、Granularity 表示白細(xì)胞顆粒的程度。在鞘流液中白細(xì)胞通過管路進(jìn)入鞘流池內(nèi)，激光照射白細(xì)胞后發(fā)生的各種散射光，根據(jù)血細(xì)胞的體積、血細(xì)胞的復(fù)雜性（有無顆粒、核的構(gòu)造等）的不同，散射光的強(qiáng)度和方向有所不同。激光散射技術(shù)日本光電公司是開發(fā)和生產(chǎn)五分類血細(xì)胞分析儀的廠家之一，目前所知僅有兩款類型的儀器投入市場(chǎng)，均采用相同的測(cè)定原理，型號(hào)是MEK7222K和MEK8222K。該類型儀器除了基本的白細(xì)胞五分類外，還提供了其它異常白細(xì)胞的信息和報(bào)警，提供給檢驗(yàn)者參考，以通過人工顯微鏡檢查復(fù)核這些結(jié)果，例如異常淋巴細(xì)胞、原始細(xì)胞、未成熟粒細(xì)胞、桿狀核中性粒細(xì)胞。這四個(gè)角度同時(shí)對(duì)單個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和分析后，即可將白細(xì)胞劃分為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞5 種?！?10176。④90176。`～110176。），可測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性的相對(duì)特征；③90176。為狹角散射光（7176?！?176。0176。紅細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓高于鞘液滲透壓而發(fā)生改變，紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白從細(xì)胞內(nèi)游離出來，而鞘液內(nèi)的水分進(jìn)入紅細(xì)胞中，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)仍然完整，但此時(shí)的紅細(xì)胞折光指數(shù)與鞘液的相同，故紅細(xì)胞不干擾白細(xì)胞檢測(cè)。多角度偏振光散射白細(xì)胞分類技術(shù)（ Multi—Angle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS）其原理是一定體積的全血標(biāo)本用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋。多角度偏振光激光散射技術(shù)美國(guó)雅培公司（ABBOTT）推出的血液分析儀，在白細(xì)胞分類中采用獨(dú)特的多角度偏振光散射（MAPSS）技術(shù)，其所生產(chǎn)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀從CELLDYN 3000，3200，3500，3700，4000，以及Sapphire（藍(lán)寶石），在白細(xì)胞分類上均采用了MAPSS 技術(shù)。最近該廠推出新一代ABX Pentra DX120 型血細(xì)胞分析儀，其測(cè)定原理仍然采用雙鞘流技術(shù)。血小板計(jì)數(shù)上還采用了防返流裝置，目的為防止渦流現(xiàn)象對(duì)血小板計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響。紅細(xì)胞和血小板仍然采用電阻抗原理測(cè)定，血紅蛋白采用比色法。在直方圖上可以看出在中心界標(biāo)左側(cè)的是細(xì)胞體積變小的其它細(xì)胞群，界標(biāo)右側(cè)是體積較大的嗜堿性粒細(xì)胞。細(xì)胞通過一個(gè)直徑為80mm 的鞘流微孔時(shí)，根據(jù)電阻抗原理進(jìn)行測(cè)定，以細(xì)胞體積大小為橫坐標(biāo)繪制WBC/BASO 直方圖。在WBC/BASO 檢測(cè)池中，全血樣品與BasolyseII（）溶血?jiǎng)┗旌希?5176。LIC 包括：大單核細(xì)胞、高嗜堿性的單核細(xì)胞、巨大中性粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞、原始細(xì)胞。⑤巨大未成熟細(xì)胞（Large Immature Cell）：未成熟粒細(xì)胞因其體積較大，可含有顆粒，光散射強(qiáng)，位于嗜中性粒細(xì)胞散點(diǎn)圖的右側(cè)，在LIC 矩陣圖中從左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒細(xì)胞，另外各種原始細(xì)胞位于單核細(xì)胞的右側(cè)區(qū)域中。同時(shí)桿狀細(xì)胞（Bands）體積與中性粒細(xì)胞接近，但核的復(fù)雜程度低，吸光率低，散點(diǎn)圖位于中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞之間。所以中性粒細(xì)胞群散點(diǎn)圖位于中部。②單核細(xì)胞：典型的單核細(xì)胞體積較大、腎狀核、胞漿內(nèi)有初級(jí)顆粒（幾乎不著色），細(xì)胞核大且不分葉，光散射較少，所以位于吸光率軸的最下端，依據(jù)單核細(xì)胞的體積，位于體積軸的最右端，而異常單核細(xì)胞及特大單核細(xì)胞則可能出現(xiàn)在LIC 的矩陣中。此通道內(nèi)在分析的同時(shí)還能夠檢測(cè)兩群異常白細(xì)胞亞群：巨大未成熟細(xì)胞（LIC）百分比及絕對(duì)值，異型淋巴細(xì)胞（ALY）百分比及絕對(duì)值，同時(shí)還可提供多達(dá)82 種提示和報(bào)警信息。根據(jù)每類細(xì)胞在這兩個(gè)分析參數(shù)上所表現(xiàn)出來的特性，形成二維分布的散點(diǎn)圖。染色后的標(biāo)本被引導(dǎo)進(jìn)入鞘流池進(jìn)行雙鞘流分析，首先經(jīng)過60mm 紅寶石小孔進(jìn)行電阻法分析，用于判斷細(xì)胞體積大小，在LMNE 散點(diǎn)圖上的橫坐標(biāo)即可表示出細(xì)胞大小的特性。在儀器的LMNE 檢測(cè)池中，全血樣品與染色劑充分混勻，在35℃條件下進(jìn)行孵育，此過程的作用是：①溶解紅細(xì)胞②對(duì)單核細(xì)胞的初級(jí)顆粒、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的特異顆粒進(jìn)行不同程度的染色，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的膜（細(xì)胞膜、核膜、顆粒膜）也進(jìn)行不同程度的著色③固定細(xì)胞的形態(tài)，使其保持自然狀態(tài)。儀器通過兩個(gè)通道來完成白細(xì)胞的五項(xiàng)分類。為了保證被檢測(cè)的細(xì)胞能夠正確通過計(jì)數(shù)孔和鞘流通道，需要利用外來鞘流來進(jìn)行矯正，因此通過左側(cè)鞘流泵注入稀釋液形成第一鞘流液，其作用是保護(hù)溶液能夠直接通過計(jì)數(shù)小孔，并且保證其中攜帶的細(xì)胞處于中心部位，液流不發(fā)生偏移和扭曲；溶液通過計(jì)數(shù)小孔后，再通過中間鞘流泵注入稀釋液形成第二股鞘流，用以保證吸光度測(cè)量。標(biāo)本首先在第一鞘流液中經(jīng)過電阻抗測(cè)定分析，得到細(xì)胞體積測(cè)定結(jié)果，然后通過第二鞘流引導(dǎo)再行光吸收率分析，對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)定，最終將細(xì)胞測(cè)定信息在散射圖相應(yīng)的位置表現(xiàn)出來。在白細(xì)胞分類上采用該公司特有的專利技術(shù)雙鞘流（DHSS）分析法。血紅蛋白測(cè)定采用連續(xù)流動(dòng)比色法和紅細(xì)胞散射光直接測(cè)定法兩種方法，有助于高脂血和高膽紅素血標(biāo)本的血紅蛋白測(cè)定準(zhǔn)確性。其根據(jù)紅細(xì)胞在體積大小和單個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白含量的分析，將紅細(xì)胞劃分為9 個(gè)區(qū)域，得到紅細(xì)胞體積和色素含量分布的九分圖，也是該儀器在紅細(xì)胞分析方面獨(dú)有的特色，根據(jù)紅細(xì)胞分布情況可初步判斷疾病類別。這兩個(gè)值不受紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白測(cè)定的影響。～15176。~3 176。該儀器在紅細(xì)胞、血小板的測(cè)定上也采用了光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。在嗜堿細(xì)胞（BASO）通道中采用的檢測(cè)原理是：專用的嗜堿性粒細(xì)胞試劑（BASO）將除了嗜堿性粒細(xì)胞以外的白細(xì)胞除去細(xì)胞膜，使其裸核化并體積變小，僅將嗜堿性粒細(xì)胞保持原有狀態(tài)，體積明顯大于其他類的白細(xì)胞。在此通道內(nèi)細(xì)胞被分為五類。15176。Advia 120/2120 血細(xì)胞分析儀的過氧化酶（Perox）檢測(cè)通道就是根據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)的，它檢測(cè)每一個(gè)通過流動(dòng)計(jì)數(shù)池中的白細(xì)胞，經(jīng)過激光照射所產(chǎn)生的過氧化酶散射光吸收率，來當(dāng)然試劑和輔助試劑均進(jìn)行了改良。在單核細(xì)胞系統(tǒng)，除早期原始階段外，幼稚單核和單核細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)較弱的過氧化物酶反應(yīng)。染色后的細(xì)胞內(nèi)無藍(lán)黑色顆粒出現(xiàn)為陰性反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)小顆?；蛳∈铇臃植嫉暮谏w粒為弱陽性反應(yīng)，出現(xiàn)黑色粗大而密集的顆粒為強(qiáng)陽性反應(yīng)。在白細(xì)胞分類上，該儀器采用兩個(gè)通道進(jìn)行，一個(gè)為過氧化酶檢測(cè)通道，另一個(gè)為嗜堿細(xì)胞檢測(cè)通道。形成的集成板被放置在儀器的明顯部位，方便觀察，并具一定的美觀效果。在儀器的管路、電磁閥門、反應(yīng)杯上采用了獨(dú)特設(shè)計(jì)的集成液流版管路系統(tǒng)，是目前血細(xì)胞分析儀中所獨(dú)有和特有的技術(shù)。根據(jù)細(xì)胞化學(xué)染色的特性進(jìn)行白細(xì)胞分類。激光散射和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)最早采用該技術(shù)的是Technicon 公司的H1,H3 型，現(xiàn)在的最新型為西門子公司的Advia120 型和2120 型（2007 年以前為Bayer 公司產(chǎn)品）。根據(jù)熒光強(qiáng)度差和前向散射光信號(hào)測(cè)定的細(xì)胞體積差，可將有核紅細(xì)胞從其他細(xì)胞群中區(qū)分出來。STROMATOLYSER－NR試劑中的聚次甲基熒光染料可滲透進(jìn)入白細(xì)胞膜內(nèi)，將白細(xì)胞和有核紅細(xì)胞的核染色。射頻技術(shù)用于測(cè)量細(xì)胞核的大小和顆粒的多少，而直流電信號(hào)可反應(yīng)出細(xì)胞體積的大小。這個(gè)測(cè)定通道根據(jù)幼稚細(xì)胞膜表面比成熟細(xì)胞膜表面含有脂質(zhì)少的現(xiàn)象，在稀釋液中加入硫化氨基酸（IM 試劑），由于占位不同，結(jié)合在幼稚細(xì)胞表面的氨基酸較多，對(duì)溶血?jiǎng)┯械挚棺饔茫瑢?duì)幼稚細(xì)胞具有保護(hù)作用。在這個(gè)通道中可以獲得白細(xì)胞總數(shù)和嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量。STROMATOLYSER –FB 是一種酸性試劑，可將紅細(xì)胞和血小板形成淡影化，將除嗜堿性粒細(xì)胞以外的白細(xì)胞處理成裸核形態(tài)，然后采用前向散射光（FSC）信號(hào)和側(cè)向散射光（SSC）信號(hào)使嗜堿性粒細(xì)胞從其它細(xì)胞中分離出來。在DIFF 散射圖當(dāng)中可以得到白細(xì)胞的四個(gè)分群（LMNE）。STROMATOLYSER 4DL 試劑還具有與嗜酸性顆粒特異性結(jié)合的能力，可根據(jù)側(cè)向散射光信號(hào)強(qiáng)度，將嗜酸性粒細(xì)胞從中性粒細(xì)胞中分離出來。在白細(xì)胞分析上主要采用兩個(gè)通道進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，兩個(gè)通道均采用激光和鞘流進(jìn)樣的方式測(cè)定。半導(dǎo)體激光照射在通過鞘流技術(shù)處理的細(xì)胞上，可根據(jù)每個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的三種信號(hào)來鑒別細(xì)胞類別。以XE2100型血細(xì)胞分析儀為例說明其在白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類方面的原理和特點(diǎn)。電阻抗、射頻和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)日本Sysmex 公司系列血液分析儀是在國(guó)內(nèi)應(yīng)用非常廣泛的儀器，從三分類法到五分類法的各種型號(hào)儀器都有大量用戶。該公司的五分類法血細(xì)胞分析儀先后推出多種類型，如MAXM、STKS、GEN也可對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等均作出其細(xì)胞群體的三個(gè)技術(shù)參數(shù)值，是比較有前景的研究?jī)?nèi)容。VCS 技術(shù)是Beckman－Coulter 公司開發(fā)研制的經(jīng)典專有方法，到目前為止的各種高檔血細(xì)胞分析儀均采用該方法對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分析。三個(gè)散點(diǎn)圖的縱坐標(biāo)均定義為細(xì)胞體積。儀器不僅僅做出對(duì)正常白細(xì)胞的五項(xiàng)分類結(jié)果，給出典型的散點(diǎn)圖型，還可以提示許多異常細(xì)胞區(qū)域的報(bào)警。將這些特征性信息被定義到以VCS 為三維坐標(biāo)(分辨率為256256256=16,777,216)所形成的立體散點(diǎn)圖中，這五類細(xì)胞可在三維空間中形成特定的細(xì)胞群。例如細(xì)胞內(nèi)顆粒粗的要比顆粒細(xì)的散射光更強(qiáng)，因此可以用于區(qū)分粒細(xì)胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜堿性三種細(xì)胞。角度內(nèi)出現(xiàn)的散射光(MALS)信號(hào)。S 代表激光散射（Scatter）測(cè)量技術(shù)，采用氦氖激光源發(fā)出的單色激光掃描每個(gè)細(xì)胞，收集細(xì)胞在10176。細(xì)胞膜對(duì)高頻電流具有傳導(dǎo)性，當(dāng)電流通過細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核的化學(xué)組份可使電流的傳導(dǎo)性產(chǎn)生變化，其變化量可以反映出細(xì)胞內(nèi)含物的信息。體積是區(qū)分白細(xì)胞亞群的一個(gè)重要的參數(shù)，它可有效區(qū)分體積大小差異顯著的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。然后應(yīng)用鞘流技術(shù)將細(xì)胞推進(jìn)到流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)池（Flowcell）中，接受儀器VCS 三種技術(shù)的檢測(cè)。該方法也稱為體積、電導(dǎo)、激光散射血細(xì)胞分析法。而技術(shù)的提高也帶來了儀器和消耗品（試劑）價(jià)格的增加。各廠家設(shè)計(jì)生產(chǎn)的此類血細(xì)胞分析儀，其在白細(xì)胞分類技術(shù)上原理各不相同，分析測(cè)定項(xiàng)目略有不同，且形式多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，試劑種類和成分也趨于復(fù)雜。COULTER 公司在1987 年開發(fā)研制其經(jīng)典VCS 技術(shù)，并推出持續(xù)具有多年影響力的、具有白細(xì)胞五分類功能的血液細(xì)胞分析儀MAXM 型。同時(shí)代日本日立公司推出圖像分析法的白細(xì)胞分析儀HITACHI 8200 型，僅僅是用于完成白細(xì)胞血片分類的儀器，沒有其他血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析能力。第四節(jié) 血液分析儀白細(xì)胞五分類法原理和散點(diǎn)圖特征一、簡(jiǎn)要發(fā)展史1974 年，一種名為HEMALOG D 的具有初步白細(xì)胞分類功能的白細(xì)胞分析儀問世。而在SYSMEX 的NE8000和SF3000 血細(xì)胞分析儀中采用了阻抗和射頻技術(shù)聯(lián)合的白細(xì)胞分類法。第三節(jié) 現(xiàn)代血液分析儀的主要進(jìn)展隨著高科技的應(yīng)用和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種先進(jìn)的血細(xì)胞分析測(cè)試技術(shù)被應(yīng)用到血液分析儀上