人重組白細(xì)胞介素-8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定-文庫(kù)吧資料
2024-10-03 10:29本頁(yè)面
【正文】 NA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰浴2分鐘。待OD600=，8000rpm 2分鐘離心，棄上清。65℃水浴15分鐘，滅活T4 DNA連接酶，用于轉(zhuǎn)化。 DNA連接在Eppendorf管中加入下列物質(zhì)構(gòu)建反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)：H2O 、10T4 DNA連接酶buffer 、pKpL3α質(zhì)粒DNA 7μl、IL8 PCR產(chǎn)物5μl、T4 DNA連接酶1μl。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。加20μl TE進(jìn)一步用于連接反應(yīng)。加50μl酚氯仿異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無(wú)水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，20℃沉底1小時(shí)。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。37℃水浴45分鐘。A管：ddH2O 16μl 、10H buffer 2μl、質(zhì)粒DNA 1μl、StyⅠ1μl。加入50μl TE使質(zhì)粒溶解，酶切備用。10000rpm 5分鐘離心，棄上清，加入70%。加200μl乙酸緩沖液，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次混勻，冰浴10分鐘（寧短勿長(zhǎng)）。加入200μl緩沖液A，充分混勻。 質(zhì)粒提取從轉(zhuǎn)化平皿上接種一單菌落到LA培液體養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，待細(xì)菌濃度增至OD600=，收獲細(xì)菌。取出凝膠板置溴化乙錠中染色20分鐘。DNA樣品10μl加5μlGEBS樣本液，在蠟面紙上混勻，全部加樣于瓊脂糖的樣品孔中。 DNA瓊脂糖凝膠電泳%瓊脂糖凝膠板。吸取上層清液轉(zhuǎn)至另一已加入5μl 3M ，加入150μl無(wú)水乙醇，20℃放置1小時(shí)。向管中余下的40μl反應(yīng)體系中加入Klenow酶 1μl，室溫30分鐘，以修平擴(kuò)增片段的3ˊ末端。在設(shè)定好的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。 94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。 試驗(yàn)方法 PCR技術(shù)擴(kuò)增hIL8cDNA在Eppendorf管中依次加入下列成份構(gòu)建總體積為50μl的反應(yīng)體系：ddH2O 37μl、10buffer 5μl、dNTPmix 5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA模板1μl、Taq酶 1μl。 PCR引物的設(shè)計(jì)、合成上游5ˊ引物：agt gct aaa gaa ctt aga tgt；下游3ˊ引物：ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct(內(nèi)含XbaⅠ酶切位點(diǎn)和TAA終止密碼)由Takara公司合成。內(nèi)切酶StyⅠ、XbaⅠ購(gòu)于Takara公司。dNTPmix購(gòu)于Takara公司。1 材料與方法 主要材料 菌株與
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