【正文】 加入 15%體積滅菌甘油，混勻，然后分裝于 Eppendorf管中， 70℃低溫冰箱中保存。 ? 挑取單菌落，接種無(wú)抗菌素的 LB培養(yǎng)基， 37℃ 搖床培養(yǎng)過(guò)夜。此時(shí)菌體膨脹成球形，細(xì)胞壁和膜的通透性增強(qiáng)。 質(zhì)粒的大量提取 聚乙二醇沉淀法 分子克隆步驟 轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細(xì)胞 ★ 目前常用的原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法有兩類(lèi)： 電穿孔轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法 ★ 電穿孔轉(zhuǎn)化法屬于物理方法，但由于受到儀器的限制，實(shí)驗(yàn)室更常用的是化學(xué)轉(zhuǎn)化法。 ? 5000rpm離心 15分鐘，棄上清； ? 加 10ml溶液 1（ 50mmol/L葡萄糖， 25mmol/L TrisHCl， 10mmol/L EDTA， ）重懸，混勻，冰浴 10分鐘； ? 加入 20ml新配置的 溶液 2（ ,1%SDS），混勻，冰浴 10分鐘； ? 加入 15ml預(yù)冷的 溶液 3（ ， pH ），混勻，冰浴 10分鐘； ? 10000rpm離心 15分鐘，棄沉淀； ? 加入等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻， 20℃ 沉淀 1小時(shí)； ? 10000rpm離心 15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥； ? 用 3 ml TE（ 10mmol/L TrisHCl， 1mmol/L EDTA， pH ）溶解沉淀； ? 加入 3 ml冰預(yù)冷的 5mol/L LiCl溶液，充分混勻， 10000rpm離心 15分鐘，棄沉淀； ? 上清中加入等體積冰預(yù)冷的異丙醇，充分混勻， 10000rpm離心 15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥； ? 500μl 含 RNA酶（ 20ug/ml） TE（ 10mmol/L EDTA， ）溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到 Eppendorf管中，室溫放置 30分鐘； ? 加入 500μl 含 13%聚乙二醇 8000的 ，充分混勻， 20℃ 沉淀 2小時(shí)； ? 于臺(tái)式離心機(jī)上 12022rpm離心 10分鐘，棄上清； ? 加入 400μl TE （ ）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次； ? 轉(zhuǎn)移水相至新的 Eppendorf管，加 100μl 10M 乙酸銨，充分混勻； ? 加 2倍體積無(wú)水乙醇， 20℃ 沉淀 1小時(shí)； ? 12022rpm離心 10分。 質(zhì)粒的小量提取 堿裂解法（試劑盒） ? 挑取單菌落接種 5毫升含適當(dāng)抗菌素的 LB培養(yǎng)基中， 37℃ 震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 質(zhì)粒的小量提取 堿裂解法 自 Qiagen公司推出快速小量提取質(zhì)粒 DNA試劑盒以來(lái)，很多公司都開(kāi)發(fā)出類(lèi)似產(chǎn)品，其原理及實(shí)驗(yàn)步驟大同小異。 ? 70%乙醇洗滌沉淀一次； ? 干燥后加入 50μl 含 RNA酶（ 20ug/ml）的 TE（ 10mmol/L TrisHCL， 1mmol/L EDTA， pH ）， 37℃ 水浴 30分鐘。 ? 12022rpm離心 3分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管； ? 加入等體積酚 /氯仿抽提一次；轉(zhuǎn)移上層水相至新的離心管； ? 等體積氯仿抽提一次。 這一步操作要注意兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組 DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組 DNA也會(huì)斷裂。 ? 取 Eppendorf管中， 5000rpm離心 1min，棄上清， ? 沉淀 懸浮 于 150μl 溶液 Ⅰ （ 500mmol/L葡萄糖， 25mmol/L TrisHCl， 10mmol/L EDTA， pH ）冰浴 5分鐘； 此步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊，否則會(huì)降低抽提得率。 ? 通過(guò)離心，去除線性染色體 DNA與不穩(wěn)定的大分子 RNA，蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物等，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒 DNA。 ? 恢復(fù) pH值中性時(shí)： 共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，恢復(fù)原來(lái)構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。 ? 在 EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。 離心流程 ? 離心收集菌體，加入溶菌酶或 SDS，促進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞裂解，離心收集含質(zhì)粒 DNA的上清。 如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板 37℃ 溫箱倒置培養(yǎng) 1216hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 由 α 互補(bǔ)產(chǎn)生 ?半乳糖苷酶可使 底物 XGal產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。 涂布在含青霉素的選擇培養(yǎng)基上，可生長(zhǎng) 涂布于含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上，不能生長(zhǎng)。 “322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累10003000個(gè)拷貝（氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成 ,阻止細(xì)胞染色體復(fù)制 ,而質(zhì)粒本身復(fù)制不受影響 ,增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)）。 共有 24種 核酸內(nèi)切酶單一酶切識(shí)別位點(diǎn)。 常見(jiàn)質(zhì)粒 1： pBR322 優(yōu)點(diǎn)： 具有較小的分子量； 分子量為 4363bp，克隆載體的分子量大小不要超過(guò) 10kb。 ? 注意事項(xiàng)： 載體 MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，目的基因與載體應(yīng)易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。 研究基因功能： overexpression, knock down, knock out 基因治療：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體 ? 載體的類(lèi)型： （ 1）克隆載體的克隆能力：理想的克隆質(zhì)粒本身要盡可能小，這樣轉(zhuǎn)化效率較 高，同時(shí)質(zhì)粒的容量較大，可以插入較大的 DNA片段。 載體分類(lèi) 載體分類(lèi) ? 按進(jìn)入受體細(xì)胞類(lèi)型分： （ 1）原核載體 （ 2）真核載體 （ 3）穿梭載體（ shuttle vector） 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，要含有不同系統(tǒng)可識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)，因而可以運(yùn)載目的基因。 在大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白的表達(dá)載體 要含有適當(dāng)?shù)脑藛?dòng)子，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。它是用來(lái)克隆和擴(kuò)增 DNA片段（基因）的載體。 多克隆位點(diǎn) 是含有多個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的一段 DNA序列，便于外源 DNA片段的插入，而且不會(huì)影響質(zhì)粒本身的穩(wěn)定。而真核生物 DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。復(fù)制子決定該質(zhì)粒的復(fù)制是嚴(yán)緊型還是松弛型。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。 把目的基因通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做 載體（ vector）。 真核生物 RNA質(zhì)粒 有殼體的 dsRNA質(zhì)粒： 由蛋白質(zhì)殼體包裹 ， 存在于某些真菌和植物細(xì)胞中 ， 由于它們酷似病毒 ， 所以也常被稱(chēng)作真菌病毒和植物隱蔽病毒 ， 或稱(chēng)類(lèi)病毒顆粒 ， 典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒 。 Col因子（ colicinogenic factor） 真核生物 DNA質(zhì)粒 環(huán)狀 DNA質(zhì)粒： 酵母質(zhì)粒，植物線粒體中的環(huán)狀 DNA質(zhì)粒，人和動(dòng)物的核 DNA質(zhì)粒等，都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。 Col因子可分為兩類(lèi)： ColE1：無(wú)接合作用，松弛型多 copy；廣泛地用于重組 DNA研究和體外復(fù)制系統(tǒng)。 R因子為環(huán)狀雙鏈 DNA分子，由相連兩個(gè) DNA片段組成，即 抗性轉(zhuǎn)移因子 和抗性決定因子 ， R因子在細(xì)胞內(nèi)的copy數(shù)可從 12個(gè)到幾十個(gè)，分為嚴(yán)緊型和松弛型，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_(dá) 20223000個(gè) /細(xì)胞。 R因子是細(xì)胞質(zhì)性質(zhì)粒，具有使寄主菌對(duì)鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等抗菌素或磺胺劑產(chǎn)生抗藥性的基因群。 ● Hfr菌株 (高頻重組菌株 )： F因子插入到染色體 DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛 ● F′ 菌株： Hfr菌株內(nèi)的 F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的 F因子，特稱(chēng)為 F′ 。 F因子（ fertility factor） 根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有無(wú) F質(zhì)粒及其在細(xì)胞內(nèi)存在狀態(tài)可將細(xì)胞分為四種類(lèi)型： ● F+ 菌株： F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。 F質(zhì)粒的整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)由三個(gè)主要區(qū)段組成：（ 1）轉(zhuǎn)移區(qū)（ 2）復(fù)制區(qū)（ 3）重組區(qū) 重組區(qū)中有 4個(gè)插入順序（ IS），通過(guò)和宿主染色體上的 IS同源重組或通過(guò)轉(zhuǎn)座， F因子可以整合到宿主不同位點(diǎn)上。 pSC10 F、 RP4； p15A,衍生質(zhì)粒 細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)： 質(zhì)粒對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)不是必須的 代表性細(xì)菌質(zhì)粒 （ 1） F因子，又稱(chēng)致育因子或性因子， 62 106Dalton， ，環(huán)狀雙鏈 DNA，編碼 94個(gè)中等大小多肽，其中 1/3基因（ tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。 有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，受到同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，使兩種質(zhì)粒最終拷貝數(shù)不同，拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的分裂中更占優(yōu)勢(shì)。 細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)： 質(zhì)粒的不親合性 定義： 在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。 pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。 重組： 在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間均可發(fā)生 存在范圍： 很多細(xì)菌如 、 Shigella、 、 Streptococcus lactis、根癌土壤桿菌等 細(xì)菌質(zhì)粒功能分類(lèi) 克隆質(zhì)粒 : 克隆一個(gè)基因或 DNA片斷 表達(dá)質(zhì)粒 : 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá) 細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)： 可以在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外獨(dú)立存在 （游離態(tài)）， 也可以通過(guò)交換摻入染色體上，以 附加體（ episome） 的形式存在； 細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)： 質(zhì)粒是一種 復(fù)制子（ replicon） ，根據(jù)自我復(fù)制能力的不同，可把 質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種； 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 的復(fù)制受細(xì)胞核控制，與染色體 DNA復(fù)制相伴隨，一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個(gè)（ 15）個(gè)拷貝； 松弛型質(zhì)粒 的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在染色體 DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到 10200個(gè)或更多。 功能： 進(jìn)入宿主菌后，帶有一些基因，產(chǎn)生毒素、 抗藥性 、固氮、產(chǎn)生酶類(lèi)、降解功能等。 大?。?其大小在 11700 kb之間。 質(zhì)粒的命名：一個(gè)小寫(xiě)字母 p加 23個(gè)大寫(xiě)字母和數(shù)字，如 pBV220， pET30。 菌株的保存與復(fù)蘇 冷凍保存 質(zhì)粒（ plasmid）是染色體以外能 自主復(fù)制的遺傳因子 不具有胞外期