動物細胞工程教學ppt課件-文庫吧資料
2025-04-19 23:39本頁面
【正文】 15min，使精子密度為 *107個 /ml； ⑤ 用注射器針頭吹吸懸浮液，以吹散精子。 其次是精子的獲能處理 ，用高離子強度液、鈣離子載體、肝素和 BSA等，以促使 Ca2+進入精子載體，使精子細胞質(zhì)中 PH升高，誘發(fā)精子獲能。體外獲能一般分為兩步， 首先是精子的洗滌 ，經(jīng)一次或多次離心后除去雜質(zhì)、精清、死精子、低活力的精子、冷凍保護液及稀釋液等。 精子獲能的一般方法 ? 精子獲能 可分為 兩個階段 ， 第一個階段 是脫去精子表面的抗原物質(zhì)和去能因子，增強膜的通透性，是一定程度上的生理學變化； 第二階段 是精子細胞膜蛋白變化，即發(fā)生頂體反應，是不可逆的結(jié)構上的獲能。 3）氨基多糖法 受精液： 通常使用 Tyrode’s 改良液和 BO液 受精方法： 微滴法 、四孔培養(yǎng)板法 精卵共培養(yǎng)的時間、溫度和氣相： 受精后，卵母細胞應立即放入溫度 39℃ ，含 5％ CO2的空氣和最大相對濕度的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24～ 44h，其中牛 22～ 24h，將假定的受精卵從受精液中取出，再在早期胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng) 18～ 33h。 ? 此外，幾乎在各種動物的精子獲能中均以 BSA作為輔助成分， BSA可以改變 (除去 )精子膜上的膽固醇含量，降低精子膜上膽固醇 /磷脂比率，改變精子膜的穩(wěn)定性，發(fā)生頂體反應。肝素是硫酸化程度最高的 GAGs，其誘導精子獲能的作用最強。 2）鈣離子載體 GAGs可促進精子對鈣離子的吸收，誘發(fā)頂體反應。如果在處理中添加咖啡因，則獲能效果更好，但 IA 對精子作用很強烈，處理時間過長或濃度過高都會導致精子急劇死亡。 精子的頂體反應是一個鈣離子依賴過程。以相同的方法處理牛精子，與成熟卵泡卵母細胞體外受精后移植，獲得了試管牛(Brackettt等， 1982)。 哺乳動物精子獲能的模型 1）高離子強度處理法 Oliphant和 Brackett（ 1973）首先用高離子強度液使小鼠精子體外獲能。能夠解除去能因子的物質(zhì)稱為獲能因子。 卵母細胞體外成熟的標志及特征 ? （ 1）生發(fā)泡破裂 ? （ 2）染色體凝集 ? （ 3）紡錘體形成 ? （ 4）第一極體排出 ? （ 5）透明帶軟化 ? （ 6）卵丘細胞擴展 影響卵母細胞體外成熟的因素 動物種類 卵母細胞的類型 卵母細胞和卵泡的大?。?— 2mm） 卵巢運輸和季節(jié)（ 6h， 30 ℃ ，繁殖季節(jié)） （ 2）培養(yǎng)環(huán)境 溫度 時間 氣相 培養(yǎng)基 （ 3）生化因子 Ca2+ 甾類激素 （ LH可誘導卵母 細胞成熟，而雄 激素和 PG則可抑制卵母細胞成熟） 卵母細胞成熟抑制因子 （ 1）卵母細胞的來源 幾種動物卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的方法 （ 1）小鼠 A、培養(yǎng)液： ++100IUPMSG或者 T6液 +4mg/mlBSA ① 于當天上午對小鼠皮下注射 5IUPMSG， 促進卵泡發(fā)育； ② 注射 PMSG46h后頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘出卵巢 ③在表面皿中 — TYH/HEPES液， 在體視顯微鏡下刺破卵泡 ④選擇充分發(fā)育的卵母細胞，在石蠟液滴（ 50—100ul/10— 20個卵母細胞）中培養(yǎng) B、方法 （ 2）牛、羊 A、培養(yǎng)液： TCM199+25mmol/LHEPES+%FBS+FSH++E2+雙抗或者TCM199++50mg/L慶大霉素++LH++%PVP B、方法： ① 從屠宰場獲取牛卵巢后，放入 25— 30 ℃ DPBS或生理鹽水中加雙抗的保溫瓶中立即帶回實驗室； ②從卵巢表面吸取 2— 8mmCOC； ③放入石蠟液滴中培養(yǎng)， 22— 26h， C02培養(yǎng)箱 三、精子獲能 概念 精子在通過附睪時已經(jīng)獲得了受精能力，但由附睪分泌的一種物質(zhì)覆蓋在頂體表面，抑制了其受精能力，這種物質(zhì)叫做去能因子。 3）培養(yǎng)時間： 牛和羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的時間一般為 22～ 24h，而馬為 30～ 36h，豬為 40～ 44h。 2）溫度和氣相： 牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的溫度一般為 38～ 39℃ 。 卵母細胞體外成熟的培養(yǎng)體系 1）培養(yǎng)液 ： 用于卵母細胞體外成熟的最為廣泛基礎培養(yǎng)液是 M199。 但在牛等大家畜卵母細胞 IVM/IVF系統(tǒng)存在兩個問題，一是 IVM/IVF的胚胎發(fā)育率較低；二是 IVM/IVF培養(yǎng)系統(tǒng)中血清和體細胞的加入使培養(yǎng)液成分復雜化，很難從中分析出影響IVM/IVF的關鍵因素。 卵母細胞體外成熟培養(yǎng)現(xiàn)狀 未成熟卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)及體外受精在小鼠研究比較深入。人工采集的卵母細胞大都完成了生長，進入成熟期；卵母細胞處于第二次成熟分裂間期而達到中期（ MⅡ ）。 其中， A級、 B級卵母細
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