【正文】 劑體系：酶分子周圍有一層水分子膜（必需水）維持酶催化反應(yīng)構(gòu)象。（9）固定化酶方法簡單，可以只沉積在載體表面。（7）無微生物污染。（5）容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物。（3）可抑制有水參與的副反應(yīng)，如酸酐的水解等。68. ：（1）增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解性?；瘜W(xué)修飾法是改造酶分子的有效方法，而且已有了一定的規(guī)律性和普遍性，具有廣泛的應(yīng)用前景。（4）化學(xué)修飾法可以在酶結(jié)構(gòu)與功能的研究方面提供信息，但是還不 夠準(zhǔn)確和系統(tǒng)。（2）化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象多少有些改變。⑴熱穩(wěn)定性提高 ⑵抗各類失活因子能力提高 ⑶抗原性消除 ⑷體內(nèi)半衰期延長： ⑸最適pH改變 ⑹酶學(xué)性質(zhì)變化 ⑺對組織分布能力改變 。⑵蛋白主鏈的修飾。（4）固定化修飾。（2）小分子修飾 。⒎其它反應(yīng)器： 概念：人造的具有酶性質(zhì)的催化劑（分子模擬立體結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)）特點(diǎn)：相對結(jié)構(gòu)簡單，高效，高催化性，蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì) 分類：： ：：： 制備過程：，：創(chuàng)造天然酶不具備的優(yōu)良特性，擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域。⒌循環(huán)反應(yīng)器：部分反應(yīng)液流出和新加入底物流入液混合，在進(jìn)入反應(yīng)床進(jìn)行循環(huán)。⒋流化床反應(yīng)器：底物以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)，達(dá)到混合的目的。⒉連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反應(yīng)器：連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料 ⒊填充床反應(yīng)器：固定化酶填充于床層內(nèi)。 方法：①載體結(jié)合法、②交聯(lián)發(fā)、③包埋法、④選擇性熱變性法 制備：⑴吸附法制備固定化酶技術(shù)⑵包埋法制備固定化酶技術(shù)①界面沉降法②界面聚合法⑶交聯(lián)法制備固定化酶技術(shù)⑷共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶技術(shù)，生物催化劑功能，固相催化劑特點(diǎn)。④胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離純化過程。②初始投資較大。⑤比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。③反應(yīng)條件易控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制。優(yōu)點(diǎn)：①可多次使用。①供氧能力及氣泡分散程度 ②剪切力大小及對細(xì)胞的影響③高密度培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液的混合程度 ④溫度、pH及營養(yǎng)物質(zhì)的控制能力 ⑤細(xì)胞團(tuán)大小的控制能力⑥易于放大：①誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞工程研究中的應(yīng)用 ②前體飼喂 ③兩相法培養(yǎng) ④轉(zhuǎn)基因技術(shù)在次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應(yīng)用 ⑤植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生物制藥 酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)。Ⅳ 產(chǎn)品提取與純化：從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有用的產(chǎn)品。Ⅱ 細(xì)胞株系建立：建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。缺點(diǎn)：固定化培養(yǎng)的植物細(xì)胞其代謝產(chǎn)物必須分泌到細(xì)胞外，多數(shù)植物細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)或分泌到液泡中。更換培養(yǎng)基帶走代謝物。采用固相培養(yǎng)，細(xì)胞有一定程度的分化發(fā)育，從而刺激調(diào)控代謝物合成的基因表達(dá)，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。缺點(diǎn)：放大困難，大規(guī)模操作困難。缺點(diǎn):高密度培養(yǎng)時(shí)混合不均勻。優(yōu)點(diǎn)：低剪切力，較好的混合，較高的氧傳遞效果。優(yōu)點(diǎn)：適于對剪切敏感的細(xì)胞的培養(yǎng)，無運(yùn)動(dòng)部件，不易染菌，相對高的熱量和質(zhì)量傳遞，放大相對容易。優(yōu)點(diǎn)：易于控制溫度、 pH、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)濃度，混合均勻。固定化反應(yīng)器：網(wǎng)狀多孔板；尼龍網(wǎng)套；中空纖維膜 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群及維持細(xì)胞間理化梯度，利于細(xì)胞組織化，易于控制培養(yǎng)條件及獲得較高含量的次級代謝產(chǎn)物。 ：植物無菌培養(yǎng)：（1）幼苗及植株的培養(yǎng)（2）愈傷組織培養(yǎng)（外植體，細(xì)胞聚集體）（3）懸浮培養(yǎng)（單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的液體培養(yǎng)）（4）器官培養(yǎng)（5）胚胎培養(yǎng) 初級代謝產(chǎn)物：核酸、蛋白質(zhì)、糖類外植體 (脫分化)→愈傷組織（再分化）→生長點(diǎn)（形態(tài)發(fā)生）→芽、根→小植株:：生物堿、黃酮類、萜類、有機(jī)酸、木質(zhì)素、皂苷類、多元酚類 次級代謝作用是由特異蛋白質(zhì)調(diào)控產(chǎn)生的內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合過程。制備方法：先克隆毒素基因，再利用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性細(xì)胞結(jié)合部位基因。 第三代免疫毒素：重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達(dá)。 第二代免疫毒素是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。（antibody directed enzyme prodrug therapy,ADEPT）關(guān)鍵是選擇適當(dāng)?shù)幕罨福八帉?。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細(xì)胞毒性提高二倍。放射性核素標(biāo)記的抗體對腫瘤細(xì)胞殺傷較大。人鼠嵌合抗體、改形抗體 、小分子抗體。對鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系。多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。 抗原與動(dòng)物免疫 制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。（107～108個(gè)/mL）產(chǎn)量高。 :取出、補(bǔ)充培養(yǎng)基，細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)是適用的細(xì)胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度；缺點(diǎn)是操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不均一，傳質(zhì)和傳氧較差。缺點(diǎn)是由于細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度一般較低 ：貼壁培養(yǎng)是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。它適用于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞），也適用于兼性貼壁細(xì)胞。成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定，來源少。缺點(diǎn):培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低，安全性問題。(⒍)動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。（⒊）正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的。⒊兼性貼壁細(xì)胞生長不嚴(yán)格依賴支持物。兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型（來源于中胚層組織的細(xì)胞）；上皮細(xì)胞型（來源于內(nèi)、外胚層組織的細(xì)胞）⒉懸浮細(xì)胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。：⑴具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性⑵盡可能減少組成工藝的步驟⑶各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)⑷工藝過程中盡可能少用試劑⑸工藝所用時(shí)間要短⑹工藝和技術(shù)必須收率高、易操作、能耗低⑺具有較高的安全性 產(chǎn)品的鑒定、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。主要應(yīng)用兩個(gè)方面：①脫鹽和更換緩沖液②蛋白質(zhì)分子的分級分離。親和層析可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸⑷凝膠過濾層析凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開。配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。⑵反相色譜和疏水色譜反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離純化的。：色譜分離方法⑴ 離子交換層析（ IEC）離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。⑤純化過程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。③收率要高。 （1）高壓勻漿法（2）高速珠磨法（3）超聲破碎法（4）（1）滲透沖擊（2）增溶法（3）： 三、重組蛋白的分離純化技術(shù)①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。采取流加補(bǔ)料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。 ：:：：⑴先使菌體生長至一定密度； ⑵：溫度、pH值、培養(yǎng)基組分、：卡拉膠：1分批培養(yǎng)；2補(bǔ)料分批培養(yǎng)；3連續(xù)培養(yǎng)；4透析培養(yǎng)；5固定化培養(yǎng)：⒈培養(yǎng)基⒉接種量⒊溫度⒋溶解氧⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)⒍ ：菌體高密度，總表達(dá)量高；生物反應(yīng)器體積??；單位體積生產(chǎn)能力高；生產(chǎn)周期短，分離成本小 ：C源、N源種類和含量；C:N含量比值；微量元素；無機(jī)鹽（磷影響表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制速率）：空氣分離系統(tǒng)提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中，提高氧傳質(zhì)能力；菌體與小球藻混合培養(yǎng)，藻細(xì)胞光合作用產(chǎn)氧供菌體呼吸。4．受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排。2．外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝。分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象?！皣?yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點(diǎn)的ppGpp的結(jié)果。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。 ②菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷：⑸工程菌的培養(yǎng)條件：外源基因的高水平表達(dá)，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關(guān)系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關(guān)，必須優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高基因表達(dá)水平。⑴外源基因的拷貝數(shù)：外源基因是克隆到載體上的，因此載體在宿主菌種的拷貝數(shù)就直接關(guān)系到外源基因的拷貝數(shù)。⑸應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑶應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。載體本身是一個(gè)復(fù)制子，具有復(fù)制起點(diǎn)。各種不同的載體，盡管分子量大小、結(jié)構(gòu)和用途上存在著較大的差異，但是作為載體，它們應(yīng)該具備一些共同的特性。DNA(克隆載體）→DNA(轉(zhuǎn)錄載體）→RNA→蛋白質(zhì)→（表達(dá)載體）：①染色質(zhì)為環(huán)狀雙股DNA分子 ②具有操縱子結(jié)構(gòu) ③結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝 ④特定區(qū)域分布特異DNA順序，因此外