rnai干擾及其應(yīng)用ppt課件-文庫吧資料
2025-01-23 15:40本頁面
【正文】 III終止位點 。長期研究。 ? 使用這類載體，需要 2段編碼短發(fā)夾 RNA序列的 DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的 pol III 啟動子下游。 包括的人源和鼠源的 U6啟動子和人H1啟動子 。 Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting 223。 ? 不適用于： 實驗需要大量的 ， 一個特定的 siRNA。 ? 不足之處：實驗的規(guī)模受到限制 ， 雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的 siRNAs， 但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制 。 ? 更重要的是能夠更快的得到 siRNAs。 ? 由于價格比其他方法高 ， 為一個基因合成 3— 4對 siRNAs 的成本就更高了 ， 比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成 。 許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成 siRNA。 ? 植物中的 RNAi跟兩種不同大小的 siRNA有關(guān)： 21nt和24ntsiRNA， 21nt由 RISC指導(dǎo)切割目的 mRNA，而 24nt則引發(fā)了系統(tǒng)性沉默和甲基化；而在動物中僅發(fā)現(xiàn) 21nt的siRNA。但內(nèi)源基因卻缺乏轉(zhuǎn)移性沉默，表現(xiàn)出沉默區(qū)域的保守性。 RNAi在植物與其他生物中的差異 ? 在植物中存在系統(tǒng)性沉默 (systematic RNAs ilencing)現(xiàn)象， RNAi不會局限于單個細(xì)胞內(nèi)，可以在細(xì)胞與細(xì)胞之間、甚至由誘導(dǎo)部位向更遠(yuǎn)的組織傳播。 Feinberg 和Hunter在線蟲細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)一種跨膜蛋白 SID1，它可以將雙鏈 RNA轉(zhuǎn)運出細(xì)胞，因此系統(tǒng)性的RNAi包括了 SID1介導(dǎo)的雙鏈 RNA在細(xì)胞間的運輸。 ? 6)可傳播性 。 ? 5)競爭效應(yīng) 。特別是 hTF158i和 hTF161i只與 hTF167i相距 9個和 6個堿基，但它們幾乎沒有抑制該基因活性的能力。在不同濃度和不同類型的細(xì)胞中， hTF167i和 hTF372i能夠抑制 85％～ 90％的基因活性， hTF562i只能抑制部分基因活性，而 hTF478i則幾乎沒有抑制基因的活性。 ? 4)位置效應(yīng) 。 ? 3)特異性 。 ? 2)需要 ATP。 Holen等也證實 1～ 100 nmol/L的雙鏈 RNA濃度對基因沉默的效果是一致的。 Elbashir等在研究中發(fā)現(xiàn)分別為25 nmol/L與 100 nmol/L的起始雙鏈 RNA產(chǎn)生的結(jié)果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。 ? 通過遺傳分析的方法 ， 目前已從線蟲中已分離到RDE2,RDE3和 Mut7等 RNAi相關(guān)的基因 。 ? 識別之后 ， mRNA與 dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換 ，原先 dsRNA 中 的 有 義 鏈 被 mRNA 代替 ， 從酶 dsRNA復(fù)合物中釋放出來 ， 而 mRNA則處于原先的有義鏈的位置 。 根據(jù)以上的實驗結(jié)果 ， 人們提出一種 RNAi作用的簡單模型 。 ? 從已經(jīng)發(fā)生 RNAi的果蠅 S2細(xì)胞中 ， Hammond等人部分純化了一種核酸酶 ， 該核酸酶具有序列特異性 ， 它僅降解與引起 RNAi的 dsRNA具有同源序列的 mRNA。 ? ③ RNAi是將與靶基因的 mRNA 同源互補的雙鏈RNA(dsRNA ) 導(dǎo)入細(xì)胞 ,能特異性地降解該 mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失 , 屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 (post transcriptional gene silence , PTGS)。 ? 如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為 ： ? ① RNAi 是指通過反義 RNA與正鏈 RNA 形成雙鏈 RNA 特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象 ,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈 RNA(有義 RNA 和反義 RNA) ,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的 mRNA 降解 ,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。 ? ② RNAi是有 dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。 ? 隨著研究的不斷深入， RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具， RNAi也越來越為人們所重視。 RNAi廣泛存在于自然界 ? 隨后， RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。 ? 他們
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