【正文】 g DNA of putative transgenic plant into fragments with Restriction Enzymes. ? Run DNA on an agarose gel ? ―Blot‖ onto a membrane ? Probe membrane ? Autoradiography +ve ve P32 labelled probe 轉(zhuǎn)基因植株中 Gus基因的 PCR檢測 PCR analysis of Gus in putative transgenic plantlets M, DNA marker。 B, stems。 a, Gus 基因由 35S啟動子驅(qū)動； b, Gus 基因由蔗糖合酶基因 RSuS1的啟動子序列驅(qū)動； c, 未轉(zhuǎn)基因水稻植株。 ?植物比較容易再生 regenerable cells Transformed cells Cells containing new DNA that are able to regenerate into a new plant 基因槍轉(zhuǎn)化法 (biolistics) ? uses a ‘gene gun’ ? DNA is coated onto gold (or tungsten) particles (inert) ? gold is propelled by helium into plant cells ? if DNA goes into the nucleus it can be integrated into the plant chromosomes ? cells can be regenerated to whole plants The Gene Gun PDS1000 Microparticle Delivery System Helium chamber Rupture disk Macrocarrier DNA coated gold particle Stopping screen Focusing device Target tissue 基因槍轉(zhuǎn)化方法在單子葉植物如玉米、水稻等用的較多。 Cointegrative 一元共整合載體 Binary vector 二元載體 LB RB 用于植物轉(zhuǎn)化的工程質(zhì)粒pCAMBIA1300圖譜 pB19hpc (Golden Rice Cassette) TL TR aphIV 35S Gt1 psy 35S rbcS crtl Hygromycin Resistance Phytoene Synthase Phytoene Desaturase TDNA Border TDNA Border Selectable Marker Gene of Interest Gene of Interest Insertion Sequence Insertion Sequence 用以轉(zhuǎn)化的載體部分結(jié)構(gòu)。 cause ‘Crown gall’ disease A natural DNA delivery system Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium is a ‘natural geic engineer’ . it transfers some of its DNA to plants ? A plant pathogen found in nature ? Infects many plant species ? Delivers DNA that encodes for plant hormones ? DNA incorporates into plant chromosome ? Hormone genes expressed and galls form at infection site 1. Auxin, cytokinin, opine synthetic genes transferred to plant 2. Plant makes all 3 pounds 3. Auxins and cytokines cause gall formation 4. Opines provide unique carbon/nitrogen source only A. tumefaciens can use! 天然 Ti質(zhì)粒的主要功能基因： 用于天然的 Ti質(zhì)粒必須要進行改造，才能用于基因工程，有幾個重要問題必須解決： (1)Ti 質(zhì)粒太大，很難進行分子生物學操作； (2)在大腸桿菌中要易于操作； (3) 轉(zhuǎn)化植物后，能夠易于篩選，不能有致瘤性； (4)單一的限制性內(nèi)切酶位點，以便外源基因的插入 TDNA中。遠距離的目的基因通過這樣周而復(fù)始的查步而獲得。 加入 4種物質(zhì)： （ 1） 作為模板的 DNA序列； （ 2）與被分離的目的基因兩條鏈 各自 5’端序列相互補的DNA引物（ 20個左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） TaqDNA聚合酶； （ 4） dNTP（ dATP, dTTP, dGTP和 dCTP）。 （ 3 ） 通過 聚合酶鏈式反應(yīng) （ PCR） 方法克隆 使用 PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或 DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應(yīng)必需的雙引物 。 ?大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列 (DNA， cDNA或寡核苷酸 )作探針 (probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫。 基因組 DNA DNA片斷 連接克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶酶切 受體菌 cDNA文庫 (plementary DNA library ， cDNA) 指生物某一發(fā)育時期或某一特定組織所轉(zhuǎn)錄的 mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA片斷與某種載體連接而形成的克隆的集合。從此，化學合成基因得到了很大的發(fā)展迅速。 常聽到的幾個名詞 Crops available that have been geically modified ? Corn ? Soybeans ? Cotton ? Canola ? Cauliflower ?Tomato ?Sugarbeet ?Papaya ?Potato ?Cabbage Not available for mercial production Wheat Barley Grapes Bananas Pineapple Carrots ?Alfalfa ?Tobacco ?Sugarcane ?Rice ?Peppers Onion Celery 2022年轉(zhuǎn)基因植物種植面積比例 大豆63% 油菜 5% 棉花 13% 玉米 19% Transgenic plants were first created in the early 1980s by three groups working independently. Subsequent research has developed transgenic plants with mercially useful traits such as resistance to herbicides, insects, and viruses. ‘83 ‘84 ‘85 ‘86 ‘87 ‘88 ‘89 ‘90 ‘91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ‘99 ‘00 ‘01 ‘02 First transgenic plant Delayripening tomato Commercialized in the US First field tests 6/92 Herbicide resistant, insect resistant plants mercialized GM maize approved by EU First Bt corn plants 6/90 Rotting resistant tomato approved by FDA 轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展簡史 基因工程主要步驟： （一）目的基因的獲取 （二）植物表達載體的構(gòu)建 （三）遺傳轉(zhuǎn)化 四、轉(zhuǎn)化細胞篩選及轉(zhuǎn)基因植株鑒定 五、外源基因整合及表達分析 六、轉(zhuǎn)基因作物新品種選育 Exogenous genes (nonplant genes) Applications transgenic pathogenderived genes bacterial genes any other anism Pathogen resistance Herbicide resistance bioreactors Delivery systems （一）目的基因的獲取 目的基因的來源 Endogenous genes (Plant genes) Gene discovery (functional genomics) Applications markers transgenic Enzymes in biochemical pathway Natural resistance genes Marker assisted breeding Plant improvement Mapping ESTs, libraries Silencing, expression Mutants, arrays （ 1）化學合成 （ 2）篩選基因組文庫或 cDNA文庫 （ 3） PCR方法 （ Polymerase Chain Reaction ） （ 4）圖位克隆 （ mapbased cloning）與染色體步移 （ chromosome Walking） （ 5） 酵母雙雜交體系 Twohybrid system 目的基因的獲得 （ 1）化學法直接合成基因 針對已經(jīng)知道序列和分子結(jié)構(gòu)的基因，在實驗室進行人工合成。 轉(zhuǎn)基因食品 (Geically modified foods， GMF，又稱基因修飾食品或基因改良食品 )，系指利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的動物、植物和微生物生產(chǎn)的食品和食品添加劑。 植物基因工程是近 20年來隨著 DNA重組技術(shù)、基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而興起的生物技術(shù)。 細菌人工染色體（ BAC） 第二節(jié) 基因工程在藥用植物育種中的應(yīng)用 基因工程是分子遺傳學和工程技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心。此質(zhì)粒含有 2種基因（ part A, part B）。 ? 缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆 DNA部分的缺失或重排。 ? 優(yōu)點：能攜帶大片段 DNA，約300kb。 BAC的環(huán)狀形式存在于 ，在宿主菌中能穩(wěn)定遺傳，沒有缺失，重組和嵌合現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化效率高，極大方便了目的基因篩選?，F(xiàn)已構(gòu)建了人、牛、豬、綿羊、小鼠、果蠅等動物以及擬南芥、玉米、番茄、大麥、甜菜、水稻和馬鈴薯等植物 YAC文庫。 酵母人工染色體 （ Yeast artificial chromosome ， YAC） YAC載體的基本組成部分： * 一段來自酵母染色體的著絲粒序列（ CEN）； * 一段控制酵母 DNA復(fù)制的自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequence, ARS) * 一對酵母的端粒序列，有的載體中（如 pYAC4）來自四膜蟲染色體； * 選擇記號； * 克隆位點 第一個酵母人工染色體 Murray和 Szostak（ 1983）在大腸桿菌質(zhì)粒 pBR322基礎(chǔ)上加入酵母著絲粒， ARS及四膜蟲的核糖體 RNA基因末端（ Tr，其結(jié)構(gòu)和功能與端粒 DNA相似）及基因，總長度為。 3） 自主復(fù)制序列（ ARS）元件： 是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點。 1） 著絲粒 ： mitosis姊妹染色單體和減 I同源染色體分離之必需。這種文庫可用來篩選目標基因的候選克隆，也可以從中篩選對某個染色體區(qū)段有特異性的探針，這些探針屬于同一連鎖群，因而可用來構(gòu)建高密度分子標記連鎖圖，進行 YAC、BAC文庫篩選。擴增產(chǎn)物可進行微克隆、構(gòu)建成染色體或染色體片段 DNA文庫。 微克隆方法有兩種； 一是酶解直接克隆法，目標染色體片段經(jīng)蛋白酶裂解后提取出目標片段 DNA，由于目標染色體 DNA的量很少，最初的染色體微切割需切割分離大量染色體（ 100~200條）； 另一是 PCR介導(dǎo)克隆法， PCR技術(shù)的應(yīng)用大大促進了染色體微切割、微克隆技術(shù)的發(fā)展。染色