【正文】 0 78 345 406 435 441 530 597 635 636 637 638 639 642 645 樣品 C G T A G T C G G G G G C A T G 越南黃檀 C T T A G T C G G C A A T G C T 多裂黃檀 T G G G T G T C A C A A T G C T 降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 11 11 圖 4 降香黃檀 ITS2 序列與其他物種該序列的進(jìn)化樹分析 tree obtained by method based on the ITS sequnence 4 結(jié)論與討論 結(jié)論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明降香黃檀 DNA 片段，用三種特異性引物擴(kuò)增 MatK，trnHpsbA， ITS2 片段，其中 trnHpsbA， ITS2 均有擴(kuò)增產(chǎn)物但只有 ITS2通過 PCR 擴(kuò)增成 功，且擴(kuò)增成功的 DNA 片段可用于測序分析，對降香黃檀分子條形碼測定的有效性最高。結(jié)果顯示，外類群槐屬植物的國槐單獨(dú)聚為一枝，與傳統(tǒng)分類結(jié)果相一致。樣品 ITS2 分子序列 黃檀屬其他植物均不同，其中 與越南黃檀差異最小有 8個(gè)位點(diǎn)堿基不同， 其次是 多裂黃檀有 15 個(gè)堿基不同。 測序結(jié)果中 :樣品 DNA 的 trnHpsbA 片段均未得到對應(yīng)序列 ，只 得到ITS2 序列長度為 654bp 如下： 降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 9 9 ACCTGAGGTCGCGTCGTGGGCGATCGACATCGCTCGCGGGTCGCTGGGTACGGAGCTGGTGGAGGCCGCCCTCATGACTGGCCTCGAGAACACGCTCAACCACCGTCTGTCATGGCGCTGCATCCACCACGAACCCGATTTTCAGCCAGCCGCGAGGCGGTGCTCACGGGAGGCCAGCATTCGCCCCGCTCCGTGGCCGGAGGCACAGGGGTTGGGGCGGCGATTGGTGACACCCAGGCAGGCGTGCCCTTGGCCTAGTGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTTGGACTCGAGTGTTGCGACGTCGCCCGTGCGAGCACCGTTTCCGGGCCGACGGGACGCGCTCTGCGATTGTTGATTCCTTGGCGCTTTCCGCGCCGGGGTTTGTTGGTTGTTTCGCCGGGACGAGAGGCCGCGGGGCGCGGCTCCGTCCCGACTTTGAGGGAAGGCGAGCTGCTGGGCAGCTTCGTCTGTCCCGGGTGTTGAAACGTGTCCGCGGGTCTCTCTGGATTGAGGCATAAGGGCAATTCTGCAGATATCCATCACACTGG 圖 3 克隆菌液 PCR 產(chǎn)物電泳檢測 Figure3. Electrophoretic analysis of PCR products of cloning escherichia coli M: DNA marker ( AL2021) ITS2: 138 。 46 :ITS2。 34: trnHpsbA,。而經(jīng)過純化后的產(chǎn)物凝膠顯示 ITS2 的條帶更為清晰。 通過實(shí)驗(yàn)得到三種引物 PCR 擴(kuò)增結(jié)果如下圖， matK 片段的擴(kuò)增成功率低，在凝膠成像圖中找不到條帶。這是對條形碼片段的初步評估。得到各樣本的片段序列信息。 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)以鑒定陽性克隆， PCR 反應(yīng)體系及條件與以葉片 DNA PCR 擴(kuò)增目的片段體系條件一致。L，輕彈懸浮菌液，取全部菌液涂板）。L 2mg/mlIPTG 和 40mg/mlXgal 混合，并均勻地涂布在準(zhǔn)備好的平降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 7 7 板上，在 37℃ 培養(yǎng)箱中放置 30min； ⑤ 待 IPTG 和 Xgal 被吸收后，取 200181。L 連接產(chǎn)物 (在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入鏈接產(chǎn)物 )，輕彈混勻后于冰中 30min； ② 結(jié)束后， 42℃ 水浴，熱激 30S，迅速再次冰浴 2min； ③ 向混合液離心管中加入 250181。 （ 2） 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 ① 在超凈工作臺上，取 50181。L T Vector 和連接液 SolutionⅠ 至同一 PCR 管中，輕彈管壁，使各組混合均勻，用手掌型離心機(jī)快速離心，集中溶液，然后置 PCR 管于 PCR 儀上， 16℃ 連接 20min。 克隆 （ 1） 純化產(chǎn)物低溫連接 于超凈工作臺上吸取 4181。 （ 2） 電泳檢測純化后的條形碼 PCR 產(chǎn)物 用 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的條形碼 PCR 產(chǎn)物。 13000*g 離心 2 min 收集 DNA 流出液。 ⑧ 室溫放置吸附柱 CA25min，徹底地晾干，避免殘留的漂洗液對下一步的實(shí)驗(yàn)造成影響。重復(fù)本操作一次。 ⑥ 加入 600μL漂洗液 PW 到吸附柱 CA2 中， 13,000*g 離心力離心 1min。若依舊有未溶膠塊，補(bǔ)加適量溶膠液或延長水浴時(shí)間，直至膠塊完全溶解。 ③ 按所切下的產(chǎn)物凝膠質(zhì)量，加入 3 倍體積溶膠液 PN。 ① 在紫外燈源下，用鋒利的手術(shù)刀片將單一的目的條形碼 PCR 產(chǎn)物條帶切下，置于滅 菌離心管中，并稱重。設(shè)置電泳儀 U=120V， I=220mA， 25 分鐘后取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈源下觀察 PCR 產(chǎn)物條帶。C 1 min,℃ 45s， 72℃ 1 min， 30 cycles 72℃ 7 min ITS2 94℃ 4 min 94℃ 1 min， ℃ 1 min， 72℃ 1min， 30 cycles 72℃ 7 min 配置 25μL反應(yīng)體系，用 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本 DNA，左邊第一孔用移液槍注入 5μL AL2021 做對照。 表 1 候選條形碼片段的擴(kuò)增引物 Table1. Primers for each candidate barcoding sequences amplification 擴(kuò)增片段 Target segments 引 物名稱 Primer name 引物序列 5’3’ Primer sequence 5’3’ MatK M1 CGATCTATTCATTCAATATTTC(22) M2 TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT(22) trnHpsbA T1 GTTATGCATGAACGTAATGCTC(22) T2 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(23) ITS I1 ATGCCTCAATCCAGAGAGACCC(22) I2 TAGCCCCGCCTGACCTGAG(19) （ 2） PCR 反應(yīng)體系 采用 25μL反應(yīng)體系，各反應(yīng)成分： TaKaRa Ex Taq， 610 Lodaing Buffer， 2μL dNTP Mixture， 1μL上游引物， 1μL下游引物， 1μL DNA模板，加入 17μL滅菌 ddH2O 至總體系 25μL。在本次研究中采用的引物長度為 20 至 23，降香黃檀 DNA 條形碼序列測定 4 4 GC 的含量為 40%60%，且沒有連續(xù)排列的 5 個(gè)堿基 [29]。L）；移液管；微波爐；紫外分光光度計(jì)（ NanoDrop ND1000）；渦旋儀（ IKA）；恒溫?fù)u床；電泳儀、電泳槽；恒溫水浴鍋；恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺；手掌型離心機(jī) 。L； 50181。 主要儀器設(shè)備 電子天平；量筒；燒杯； PCR 儀；凝膠