【正文】 庫，并進(jìn)行大量的測(cè)序，成本昂貴。 c AFLP 易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，適合大批量樣品分析。 和這些標(biāo)記技術(shù)相比 ， AFLP 的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在： a 與 RAPD 相比， AFLP 的引物為 1620 個(gè)核苷酸組成，而 RAPD 只有 10 個(gè)核苷酸組成，其可靠性和重復(fù)性更高。然而 AFLP 的高效和可靠帶來試驗(yàn)上更高的費(fèi)用和更為復(fù)雜的操作過程，并且它對(duì) DNA 的純度和內(nèi)切酶質(zhì)量的要求較高，加上該技術(shù)已申請(qǐng)專利權(quán)，這些因素在很大程度上也限制了 AFLP 的應(yīng)用。因此，為不同來源和不同復(fù)雜程度基因組的分析提供了一個(gè)有力的工具 （ 翁躍進(jìn) ， 1996） 。 AFLP 擴(kuò)增片段的譜帶數(shù)取決于采用的內(nèi)切酶及引物3?端選擇堿基的種類、數(shù)目和所研究基因組的復(fù)雜性。所用的 PCR 引物 5?端與接頭和酶切位點(diǎn)序列互補(bǔ)， 3?端在酶切位點(diǎn)后增加 13 個(gè)選擇性堿基，使得只有一定比例的限制性片段被選擇性地?cái)U(kuò)增 ，從而保證 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物可經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來分辨。 其基本原理是 ， 通過對(duì)基因組 DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測(cè) DNA酶切片段長度的多態(tài)性。 ISSR 技術(shù)所用的 PCR 引物長度在 20 個(gè)核 苷 酸左右，因此可以采用與常規(guī) PCR 相同的反應(yīng)條件，穩(wěn)定性比 RAPD 好 （ Zietkiewicz， 1994）。 與 SSR 技術(shù)原理相似的標(biāo)記還有 ISSR，它是利 用同位素標(biāo)記 SSR 序列，在引物的 5′和 3′端分別加入 1~2 個(gè)選擇性堿基，引物長度 16~18bp。 ④ 每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，便于不同的實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開發(fā)引物。不像 RFLP 和 RAPD 那樣存在某種模糊性 （葉少平， 2021）。 SSR 標(biāo)記具有以下一些優(yōu)點(diǎn)： ① 具有多等位基因的特性，提供的信息量高 ，一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一多等位基因位點(diǎn)。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴(kuò)增帶的遷移距離，就可知不同個(gè)體在某個(gè) SSR 座位上的多態(tài)性 （ 劉勛甲 ， 1998）。由基本單元重復(fù)次數(shù)的不同形成 SSR 座位的多態(tài)性 （ Ramesh， 2021） 。 SSR 的基本重復(fù)單元是由幾個(gè)核苷酸組成的，重復(fù)次數(shù)一般為 10~50（ Miyao， 2021） 。 但 RAPD標(biāo)記一般表現(xiàn)為顯性遺傳，不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型，因而提供的信息量不完整；另外，由于 使用了較短的引物， RAPD 標(biāo)記的 PCR 易受環(huán)境條件的影響，結(jié)果的重復(fù)性較差。擴(kuò)增產(chǎn)物一般通過瓊脂糖電泳分離，經(jīng) EB 染色來檢測(cè)。它的基本原理是：采用隨機(jī)合成的寡核苷酸（通常 10bp）作 PCR 反應(yīng)的引物，對(duì)所研究生物基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 若引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置，且與引物的 3′端相距一定范圍，就可擴(kuò)增出 DNA 片段。目前為止己 利用 RFLP 技術(shù)建立了果蠅、雞、鼠、牛、羊、豬、人等動(dòng)物以及玉米、番茄、水稻、馬鈴薯、大麥、大豆、小麥等植物的連鎖圖譜（黃德娟， 1999；鄧儉英， 2021）。 RFLP 技術(shù)在生物遺傳圖譜構(gòu)建中得到了廣泛應(yīng)用。其 技術(shù)原理是基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切消化核酸以及標(biāo)記的 DNA 探針能與任何序列相似的片段雜交 ， 通過片段長度的變異檢測(cè)多態(tài)性。幾種常用的分子標(biāo)記技術(shù)如下。王志林等（ 2021）把分子標(biāo)記技術(shù)分為以分子雜交為基礎(chǔ)的，以 PCR 為基礎(chǔ)的和以芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的 3 個(gè)類型；方宣鈞等（ 2021）依據(jù) DNA 多態(tài)性的檢測(cè)手段，將 DNA引 言 7 標(biāo)記分為 4 大類：基于 DNADNA 雜交的 DNA 標(biāo)記、基于單核苷酸多態(tài)性的 DNA 標(biāo)記。 DNA 分子標(biāo)記 1980 年興起的分子標(biāo)記技術(shù)到目前已經(jīng)經(jīng)歷了 30 余年歷史，在這 30 余年中一些新的分子標(biāo)記技術(shù)不斷問世，并被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。 因此在分子標(biāo)記輔助育種、 QTL（數(shù)量性狀基因定位）制圖、遺傳多樣性 、 分子進(jìn)化等需要大量標(biāo)記的研究中，同工酶標(biāo)記逐漸為 DNA 標(biāo)記所取代。 這就導(dǎo)致 同工酶分析在植物的研究上受到發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響，在研究中特別強(qiáng)調(diào)取材的一致性。 鑒于 同工酶作為生物基因表達(dá)的產(chǎn)物， 其 受到嚴(yán)格的遺傳控制 ，因此 同工酶可以作為物種的遺傳標(biāo)記， 其可應(yīng)用在 物種和親緣關(guān)系的鑒定、新物種的尋找和開發(fā)、植物的發(fā)育生物學(xué)分析等方面，在分子標(biāo)記的發(fā)展中起到重要作用（ 趙堅(jiān)義 ， 1998） 。前者稱為 “ 等位酶 ” 。 同工酶標(biāo)記 同工酶是指催化同一反應(yīng)而結(jié)構(gòu)不同的一簇酶 ，是 一類底物相似或完全相同的酶分子形式。 廣義上講，分子標(biāo)記包括兩類，即同工酶標(biāo)記和 DNA 標(biāo)記。 ④ 不受組織、器官、環(huán)境條件和發(fā)育時(shí)期的限制，具有很高的穩(wěn)定性，直接以 DNA 的形式表現(xiàn)。 ② 不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖 ， 表現(xiàn)為 “中性” 。因此，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為植物標(biāo)記輔助育種提供了一東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 6 條嶄新的途徑。 DNA 分子 標(biāo)記 對(duì)隱性農(nóng)藝性狀的選擇十分有利，主要表現(xiàn)在其不受 基因表達(dá)的影響，可在任何組織、任何發(fā)育階段進(jìn)行檢測(cè)，而且大多數(shù)分子標(biāo)記呈現(xiàn)共顯性。 分子標(biāo)記技術(shù) 分子 標(biāo)記 （ DNA 標(biāo)記 ）是 遺傳標(biāo) 記的一種類型， 可以明確反映基因組中任何座位上的相對(duì)差異的生物特征（方宣鈞等， 2021） 。 （ 5）農(nóng)藥防治 防治白斑病，應(yīng)從蓮坐期發(fā)病時(shí) (病株率 5%～ 10%)開始打藥為好。 （ 4）農(nóng)業(yè)措施 實(shí)行輪作，與非十字花科蔬菜輪作 2～ 3年。這樣，可促使植株生長健壯，增強(qiáng)抗病力。追肥前重后輕，即蓮坐期每畝施碳銨 30 千克；包心中、后期，隨水帶肥，畝施碳銨 20 千克 。施足底肥，增施磷鉀肥。收獲后，清潔田園，深翻曬上，把病株和病葉埋入上中，消滅過 冬菌源。 （ 2）清除初侵染源 種子消毒可用 50℃的溫水侵種 20min 后，移入冷水中冷卻，晾干播種 。 大白菜品種對(duì)白班 病菌的抗性存在一定的差異，可選用抗病品種是防治大白菜白斑病的最經(jīng)濟(jì)有效的措施。這種抗性表現(xiàn)親代和子代間存在極顯著正相關(guān)，苗期人工接種鑒定和田間成株抗性鑒定發(fā)病趨勢(shì)一致的，呈現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)。研究表明大白菜抗白斑病菌的抗性受 4 對(duì)以上基因控制，為不完全顯性，回交效應(yīng)顯著，正反交差異不顯著呈現(xiàn)核遺傳，細(xì)胞質(zhì)作用不顯著。氨基酸同抗病性達(dá)到極顯著正相關(guān)的主要原因是氨基酸同酚類化合物能發(fā)生縮合反應(yīng)而形成對(duì)微生物有毒的產(chǎn)物，氨基酸對(duì)病原物的直接的抑制作用可能性不大，它可能是合成病原菌抑制劑的基礎(chǔ)物質(zhì)，尤其是谷氨酸，是合成許多氨基酸的前體，至于這 3種氨基酸是如何合成病原菌抑制劑的原理，還有待于進(jìn)一步研究。結(jié)果表明過氧化氫酶活性同抗病性呈極顯著負(fù)相關(guān)，可溶性糖、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸同抗病性達(dá)到極顯著正相關(guān)。全部材料進(jìn)行苗期人工接種抗病性鑒定。通過生理生化性狀分析，間接鑒定大白菜品種對(duì)白斑病的抗性，為生理生化育種奠定理論基礎(chǔ)。通過找出與大白菜抗白斑病相關(guān)的生理生化性狀，就可以在苗期分析這些性狀，以此來鑒定抗白斑病的能力，克服了室內(nèi)人工控制接種鑒定方法的不足。不同抗性的親本所配的不同組合及世代抗性不同的原因可能是因?yàn)榇嬖谥c抗性相關(guān)的生理生化性狀的差異 。 （ 2）抗性生理生化的研究 大白菜白斑病對(duì)大白菜的危害程度，受很多因素的影響。表現(xiàn)感病的品種有福山包頭、城陽青、丹東中花心、翻心白、翻心黃、鵪鶉囤及膠三葉等。用軟毛筆輕輕掃下分生孢子，以 %蔗糖水液配成孢子懸浮液，其孢子濃度約為 106 個(gè) /ml、噴霧接種 于大白菜 4 真葉齡的苗上，事后覆蓋塑料薄膜保濕 4872h，溫度 1820℃，觀察記載發(fā)病情況。 抗性鑒定 （ 1）苗 期抗病性鑒定 魏毓棠在前人的研究基礎(chǔ)上，制定了一套大白菜白斑病苗期鑒定技術(shù)。大白菜白斑病一般在 8月中、下旬開始發(fā)生， 9月份發(fā)病最盛， 10月以后病害逐漸減少。侵入后菌絲體在寄主組織內(nèi)蔓延，環(huán)境條件適宜時(shí)，在病部長出分生孢子，引起再次侵染。 侵染循環(huán) 病菌主要以菌絲體，特別是分生孢子?；康木z塊隨病葉遺落在土表越冬，也可以菌絲體在菜株的病部越冬。 (5)栽培 管理 連作病地發(fā)病重。 (4) 品種 選種抗病品種，發(fā)病可減輕；相反，種植感病品種，發(fā)病就重。如果溫度在 11～ 20℃ ，晝夜溫差大，又多雨，或結(jié)露多，造成的溫暖潮濕的環(huán)境發(fā)病重，病害容易流行。 (2)濕度 當(dāng)相對(duì)濕度在 60％以上時(shí)， 有 利于分生孢子產(chǎn)生和萌發(fā)，侵染植株發(fā)病。 發(fā)病條件 (1 溫度 大白菜 白斑病在 5～ 28℃均 可發(fā)病，最適宜的溫度為 11～ 23℃ ， 大白菜 白斑病屬低溫病害。 在 25℃溫度條件下，孢子濃度為光學(xué)顯微鏡下（ 1040）平均每視野 910 個(gè)孢子，觀察 2472h，以 48h后 1%蔗糖溶液萌發(fā)率最高（ %），1%白菜汁液次之（ %），對(duì)照無菌水為 %。該菌在 PDA 培養(yǎng)基上只長菌絲 ， 不長孢子 。分生孢子梗 2～ 10 簇 生 ，從葉背的氣孔伸出，線形，大小 7～ 2～ ，無色，單胞，直或稍彎曲，頂端著生分生孢子 1 個(gè)。 異名 Cercospora allbomaculans（ Ev） Leptosphaeriaolericola ，屬于囊菌門真菌。 病原 病原菌為 Pseudocercosporella capsellae( Ell.amp。 后期病斑呈半透明狀，組織變薄，容易破裂穿孔。發(fā)病初期葉面上出現(xiàn)灰褐色微小的圓形斑點(diǎn)，以后逐漸擴(kuò)大成圓形、卵形或不正圓形病斑，中央變成灰白色，病斑直徑 3～ 10 mm，有不明顯的輪紋，邊緣有蒼白色或淡黃綠色的暈圈，稍凹陷。同時(shí)大白菜 白斑病常與霜霉病同時(shí)發(fā)生，引起葉片早期枯死，直接影響了秋白菜的產(chǎn)量和品質(zhì) （陳秀環(huán)， 2021） 。大白 菜整個(gè)生長期均可受害，尤以 10月份發(fā)病較多。該病害除為害白菜外，還可侵染十字花科的許多其他蔬菜，如甘藍(lán)、油菜、花椰菜、蘿卜、芥菜、小青菜、烏塌菜等，是一種分布廣、寄生多的病害 （王迪軒等， 2021） 。 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 2 文獻(xiàn)綜述 大白菜白斑病的研究進(jìn)展 大白菜白斑病是白菜類蔬菜發(fā)生較普遍的一種病害，近年來有逐年加重的趨勢(shì)。由于新品種提高了抗病性，可以減少農(nóng)藥的 使用量，減少對(duì)土壤環(huán)境、產(chǎn)品的污染，為生產(chǎn)綠色大白菜奠定基礎(chǔ)。由于新品種提高了抗病性，在我國北方地區(qū)可以提早播種，早秋收獲，延長 大 白菜加工期，擴(kuò)大北菜南運(yùn)，進(jìn)一步增加播種面積，提高農(nóng)民經(jīng)濟(jì)效益。 建立 大白菜 抗 白斑病菌 育種分子標(biāo)記輔助選擇系統(tǒng)并應(yīng)用于育種實(shí)踐，將最直接地為我國白菜抗病育種提供一批育種新材料與種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)，可加快白菜抗病優(yōu)質(zhì)新品種的選育速度。 本試驗(yàn)以高 抗白斑病菌的大白菜高代自交系 A1543 和高感白斑病菌的大白菜高代自交系 P9903為父母本 雜交的 F2 代 248 個(gè)單株作為圖譜構(gòu)建的群 體，采用 AFLP 標(biāo)記構(gòu)建大白菜分子遺傳圖譜。嚴(yán)重時(shí)葉片病斑融合成大的病斑，葉片逐 漸枯黃脫落，對(duì)品質(zhì)和產(chǎn)量影響很大。該病害主要危害葉片，在葉上產(chǎn)生斑點(diǎn)，影響光合作用，從而降低產(chǎn)量。牛心大白菜適于加工朝鮮辣白菜、酸菜，市場(chǎng)前景看好。因而對(duì)大白菜的深入研究有很大的經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)實(shí)意義。大白菜對(duì)某些疾病有明 顯療效，特別是對(duì)于胸悶脹飽、腸熱便秘、酒精中毒及消化不良等癥有較好療效。 特別是 在北方高寒地區(qū)，是城鄉(xiāng)人民秋、冬、春三季食用的露地生產(chǎn)蔬菜 。 其原產(chǎn)地是 中國，是我國主栽的蔬菜作物之一，在蔬菜周年供應(yīng)中占 有很 重要地位 。 關(guān)鍵詞 大白菜 ；分子遺傳圖譜 ； 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 （ AFLP） ； 數(shù)量性狀位點(diǎn)（ QTL） ；大白菜白斑病菌 Abstract III Construction of Molecular Geic Map and QTL Analysis of Resistance in Chinese Cabbage Abstract Chinese cabbage originated in China, it is one of vegetables which are distributed widely and are planted in the largest area in China. Chinese cabbage is the most important vegetable in Heilongjiang province, it is planted in the more than 90,000 yield is about 40 percent of the total annual market vegetable, and it plays an important role in people39。 R05 和R06 被定位在 LG13 上， R05 能解釋表型變異的 %， R06 能解釋表型變異的 %，6 個(gè)位點(diǎn)的總貢獻(xiàn)率為 %， 因此推斷大白菜抗 白斑病菌 抗性為不完全顯性基因控制，至少受 6 對(duì)以上顯性基因的控制，支持?jǐn)?shù)量性狀基因控制 白斑病 抗性的觀點(diǎn)。分別命名為 R0 R0 R0 R0 R05 和 R06。 同時(shí)又對(duì) F2代群體標(biāo)記的來源進(jìn)行了分析，結(jié)果表明： 用于構(gòu)建圖譜的 124 個(gè) AFLP標(biāo)記中，來自 A1543 的標(biāo)記有 67 個(gè)，占 %，來自 P9903 的標(biāo)記