限制性內切酶的應用(參考版)
2024-08-27 00:25本頁面
【正文】 。有些酶在高的甘油濃度中會產生星號活力。 谷氨酸鉀緩沖液適用所有的酶切。 應用中的疑問 一次使用兩個限制性內切酶的一般步驟是什么（比如雙酶切）？ 其步驟如同使用一個限制性內切酶的一般步驟。 舉例 質粒 DNA （ 2ug/ ul） 5 ul 10X反應液 5 ul 酶（ 5ug/ ul） 5 ul dH2O 35 ul 總體積 50 ul 37 oC保溫 23小時。一般酶的最適溫度為 37 oC，但有例外。 D）加入計算好的 DNA， 10X反應液，酶。為使終體積中甘油的濃度低于 8%，計算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為 5%）。若實驗結果表明底物 DNA降解，則說明DNA在純化過程中或反應液里引入了核酸酶污染；若實驗結果發(fā)現底物 DNA保持完整，而對照 DNA被成功切開，則可以排除酶質量的原因，此時可以將對照 DNA和待切底物 DNA混合起來再次進行反應，以確定樣品中是否有抑制劑。高于 20℃ 條件下穩(wěn)定性將有所降低 1對照反應 如果發(fā)現 DNA底物不能被成功切開，可以進行對照實驗以查明原因。 BSA不能與 NEBuffer混合后保存，否則將會出現 BSA沉淀 1穩(wěn)定性 每隔 12個月都會對所有的酶有一個活性檢測；最近的一次檢測結果將被貼在售出的每一管酶上。少部分酶則須在70℃ 長期保存。此外，酚 /氯仿抽提也可以用于終止反應。如果要進行下一步酶切反應，可用熱失活法終止反應（ 65℃或 85℃ ， 20分鐘）。如果加入的酶較多，可以相應地縮短反應時間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長時間以使反應達到完全 終止反應 如果不進行下一步酶切反應，可用終止液來終止反應。注意：不可振蕩！ 反應溫度 大部分酶的反應溫度為 37℃ ；從嗜熱菌中分離出來的內切酶則要求更高的溫度。想要反應完全，必須使反應液充分混合。較小的反應體積更容易受到移液器誤差的影響。不需要 BSA的酶如果加了 BSA也不會受太大影響 反應體積 內切酶活力單位的定義是： 1小時內， 50μl反應體積中，降解 1μg的底物 DNA所需的酶為一個活力單位。使用時的緩沖液濃度應為1X。 DNA 待切割的 DNA應當已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。酶應當是最后一個被加入到反應體系中（在加入酶之前所有的其它反應物都應當已經加好并已預混合）。突出端），也可以是平端的片段。內切酶的產物可以是粘端的（ 339。識別堿基數目少的酶比堿基數目多的酶更頻繁地切割底物。比如，酶切 1ug lambdaDNA，需要 12單位的酶，而酶切 1ug質粒 DNA，需要 35單位的酶。如果加入更多的酶，則可相應縮短反應時間；如果減少酶的用量，對許多酶來說，相應延長反應時
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