【正文】 (蛋白質(zhì)中一個氨基酸的平均分子量為 120) 名詞解釋 等電點 （ pI） 肽鍵和肽鏈 肽平面及二面角 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性 分子病 肽 。 已知某蛋白質(zhì)的多肽鏈的一些節(jié)段是 ?螺旋 ， 而另一些節(jié)段是 ?折疊 。 問答題和計算題 為什麼說蛋白質(zhì)是生命活動最重要的物質(zhì)基礎(chǔ) ？ 試比較 Gly、 Pro與其它常見氨基酸結(jié)構(gòu)的異同 ， 它們對多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的形成有何影響 ？ 試舉例說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （ 包括一級結(jié)構(gòu) 、 高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ） 。 ： 若某一蛋白質(zhì)中某一特定成分含量為 x%， 且該組分只有一份 ， 則 最低分子量 = 原子量 （ 分子量 ） ? 100 /x aa殘基的平均分子量為 110,用蛋白質(zhì)分子量除以 110， 可粗略估計出其 aa殘基數(shù) ， 在解題時常常遇到這一常數(shù) 。 電泳載體：丙烯酰胺 （ Acrylamide， 簡稱 ACE） 為單體 ， 以N， N亞甲基雙丙烯酰胺 （ Bis） 為交連劑 ， 有柱狀和垂直狀兩種 。 ： 電泳：帶電顆粒在電場中向著與之所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象 。 Ultracentrifugation 因為沉降系數(shù) S大體上和分子量成正比關(guān)系 ， 故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量 ， 但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用 。 Gel filtration chromatography Ion exchange chromatography Affinity chromatography （ 5）超速離心 * 超速離心法 (ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量 。 ? 凝膠過濾 (gel filtration)又稱分子篩層析， 利用 各 蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 Native PAGE SDSPAGE （ 4）層析 層析 (chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 *等電聚焦電泳 ，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 （ 3）電泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負(fù)極移動 。 * 免疫沉淀法： 將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。 除了丙酮以外 ， 也可用乙醇沉淀 。 （ 2）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用 丙酮沉淀 時 ， 必須在 0～ 4℃ 低溫下進(jìn)行 ，丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積 。 雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物 紅紫色絡(luò)合物 (鹼性溶液 ) Cu2+ 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 （ 一 ） 、 一般步驟 材料的預(yù)處理 破碎細(xì)胞 蛋白質(zhì)的粗提 （ 與雜質(zhì)分開 ） 將蛋白質(zhì)沉淀出來 （ 等電點 、 鹽析法 、 有機(jī)溶劑法 ） 粗制品的純化 （ 凝膠過濾法 、 纖維素柱 色譜法 、 親和層系法 ） Protein Purification Selection of a protein source Homogenization and solubilization Ammonium sulfate precipitation Dialysis Further purification Ultracentrifugation Electrophoresis Chromatography （二）、蛋白質(zhì)的純化方法 （ 1）透析及超濾法 * 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 （四）蛋白質(zhì)的含量測定方法 （ 1) 紫外吸收法 （ 2） 考馬斯亮藍(lán) G250法 （ 3） Folin法 （五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) ⒈ 茚三酮反應(yīng) (ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。 有機(jī)溶劑：破壞水化層 ， 使蛋白質(zhì)分子間靜電作用增 加而聚焦沉淀 ， 如乙醇 、 丙酮等 。 主要沉淀因素及機(jī)理： 無機(jī)鹽類：如硫酸銨 ， 破壞其雙電層 ， 使蛋白質(zhì)失去 電荷而析出 。 可分為兩種類型： 可逆性沉淀作用：蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀后 ， 用透析等方法除去 沉淀劑 ， 可使蛋白質(zhì)重新溶于原來的溶 液中 。 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 * 蛋白質(zhì)沉淀 在一定條件下 ， 蛋白質(zhì)疏水側(cè)鏈暴露在外 ， 肽鏈會 相互纏繞繼而聚集 ， 因而從溶液中析出 。 ?此外，防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 ?變性后蛋白質(zhì)的特征 處于伸展?fàn)顟B(tài) ， 溶解度降低 ， 易酶解 ， 分子的不對稱性增加 。 ? 造成變性的因素 如 加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。同時又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（ salting out）。這種方法稱為透析（ dialysis）。 可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基 ， 對水有很高的親和性 ， 通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層 水化層 ， 同時這些顆粒帶有電荷 ， 因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體 。 * 處于等電點的蛋白質(zhì)溶解度最低 . （二）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一 ， 分子量可自1 萬至 100 萬之巨 ， 其分子的直徑可達(dá) 1 ～100nm， 為膠粒范圍之內(nèi) 。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離 （一）蛋白質(zhì)的兩性電離 一、理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外 ，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán) ， 在一定的溶液 pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán) 。 C：為什么 ？ *血紅蛋白四個亞基中央有一個孔穴 ， BPG就結(jié)合在這個孔穴中 ， 在生理條件下 ， BPG帶負(fù)電荷 ， 可與血紅蛋白兩條 ?鏈上帶正電荷的堿性 aa形成鹽鍵 ， 加上原來的八個鹽鍵 ， 使血紅蛋白結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定 ， 不易結(jié)合 O2(脫氧情況下 )。 它在血液中與血紅蛋白等摩爾存在 。 為什么 2， 3二磷酸甘油的存在可以降低血紅蛋白與 O2的親和力，有何生理意義？ A： BPG是紅細(xì)胞在無氧或缺氧情況下的代謝產(chǎn)物 。 Bohr效應(yīng)的生理意義 A：當(dāng)血液流經(jīng)組織 ， 特別是代謝旺盛的組織如肌肉 時 ， 這里的 pH較低 ， CO2濃度較高 ， 氧合血紅蛋 白釋放 O2， 使組織獲得更多 O2， 供其需要 ， 而 O2 的釋放 ， 又促使血紅蛋白與 H+與 CO2結(jié)合 ， 以緩 解 pH降低引起的問題 。 如果是促進(jìn)作用則稱為 正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity) 如果是抑制作用則稱為 負(fù)協(xié)同效應(yīng) (negative cooperativity) O2 血紅素與氧結(jié)合后 ， 鐵原子半徑變小 ， 就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中 ， 繼而引起肽鏈位臵的變動 。 氧合 Hb占總 Hb的百分?jǐn)?shù)（ 稱 百分飽和度 ） 隨 O2濃度變化而改變 。 由此 Monod提出了蛋白質(zhì)的變構(gòu)作用 。構(gòu)象改變也影響其它亞基結(jié)合 O2。 2條 ?鏈 ， 2條 ?鏈 ， 4個血紅素輔基 ， 每條 1個 ， 由 4個原卟啉和 1個鐵原子組成 ， 形成 6個配位鍵 ， 4個與原卟啉的 N原子結(jié)合 ， 1個與 His93結(jié)合 ， 另 1個可與 O2或水結(jié)合 ， 當(dāng)未與 O2結(jié)合時 。 一個血紅素輔基 ， 75%為 ?螺旋 ， 內(nèi)部為非極性 aa， 血紅素在表面 ， 通過 His93和 His64與內(nèi)部相連 ，His64存在于第六位配位鍵上 ， 可避免 Fe2+氧化 。 舉例說明：不同的 aa順序可以產(chǎn)生相同的空間構(gòu)象 ， 因而執(zhí)行相同的生物學(xué)功能 。 glu pro leu C(146) HbS β 肽鏈 HbA β 肽 鏈 Nval glu thr his A、 分子病的概念：由于遺傳基因的突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子 結(jié)構(gòu)的改變或某種蛋白質(zhì)缺乏引起的疾病 。 可變殘基隨進(jìn)化而變異 ， 親緣關(guān)系越近 ， aa差異越小 （ 繪出進(jìn)化樹 ） 。 這種 aa順序中的相似性稱為順序同源現(xiàn)象 。 它的一級結(jié)構(gòu)中有許多位置的 aa對所有種屬來說都是相同的 ， 稱為不變殘基 。 （二）一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 同源蛋白質(zhì)的研究：也叫同功能蛋白質(zhì) ， 有助于研究生物進(jìn)化 。 血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)的測定由佩魯茨 1958年完成，其結(jié)構(gòu)要點為： ?球狀蛋白，寡聚蛋白，含四個亞基 ?兩條 α鏈，兩條 β鏈， α2β2 ?α 鏈： 141個殘基； β鏈： 146個殘基 ?分子量 65 000 ?含四個血紅素輔基 ?親水性側(cè)鏈基團(tuán)在分子表面，疏水性基團(tuán)在分子內(nèi)部 蛋白質(zhì)分子中的結(jié)構(gòu)層次 :