【正文】 制備探針的方法有DNA缺口平移標記、隨機引物標記、DNA末端標記、寡核苷酸末端標記、引物延伸法標記、RNA探針標記以及非同位素標記等。思考題 一步法和兩步法RTPCR的有何差別，在實際應用上體現(xiàn)在哪些方面？實驗十三 DNA探針制備實驗目的 了解雙鏈DNA的缺口平移和隨機引物標記法的原理以及掌握其技術。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實驗，應將PCR產(chǎn)物冷凍保存。當RNA為Positive Control RNA時，反應條件如下。2 按下列組成配制RTPCR反應液。當把Control RNA經(jīng)RTPCR合成的雙鏈cDNA插入質粒時，該質粒便可獲得四環(huán)素抗性。本試劑盒中的Control RNA是以pSPTet3質粒（ kbp的pBR322來源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四環(huán)素基因）為模板由SP6 RNA聚合酶經(jīng)體外轉錄而得到的。RNA→cDNA→PCR反應操作在同一反應體系中進行，反應中途不需添加任何試劑，就可以完成由AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由來的反轉錄酶從RNA反轉錄為cDNA，再由AMVOptimized Taq擴增cDNA的全部反應。也可以根據(jù)已知基因的序列設計引物，以基因的特異引物進行逆轉錄，得到特異基因的cDNA，以此為摸板PCR擴增得到特異基因片段，由于此法轉錄和PCR擴增在同一反應管中進行，轉錄和擴增的引物相同，因此稱為一步法。真核生物的mRNA 的3端有多個腺苷酸，形成寡聚腺苷酸的尾巴，因此可以與Oligo dT結合，在反轉錄的作用下形成cDNA。迄今為止，此方法已廣泛應用于RNA的構造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達解析等多種領域。實驗原理 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶鏈式反應）是一種體外擴增DNA的簡單而有效的方法。%DEPC處理過夜，再高壓滅菌30分鐘以出去痕量DEPC。不是一次性使用的玻璃和塑料制品，用前應除RNase。一直帶塑料手套。為防止污染，應在超凈臺上無菌操作。如果A260/（－），說明RNA的純度很好。結果在凝膠上可以看到一般可以看到三條帶，其中從上樣孔開始對應的帶的分別是28S,18S和5S，其中18S和28S的條帶明顯清晰，而5S的帶比較弱，28S的帶的亮度是18S帶亮度的2背左右，說明RNA保持完整。電泳結束后浸入溴化乙錠溶液（0．5ug／m1，用0．1mol／L乙酸銨配制）中染色3045分鐘。 甲醛凝膠加樣緩沖液 50％ 甘油 1mmol／L EDTA（pH8．0） 0．25％ 溴酚藍 ％ 二甲苯青FF 加樣前，將凝膠預電泳5分鐘，電壓降為5V／cm，隨后將樣品加至凝膠加樣孔。 甲醛（）通常為37％的水溶液（／L），. 在一滅菌的微量離心管內混合下列液體，以制備樣品： RNA（多達30ug) 4ul 5x甲醛凝膠電泳緩沖液 21ul 甲醛 甲酰胺 于65 C溫育15分鐘，冰浴冷卻，離心5秒鐘使管內所有液體集中于管底。在化學通鳳櫥內灌制凝膠。 小心：DEPC有致癌之嫌，須小心操作。用2mol/,加10ml經(jīng)用DEPC處理的0．5mol／L EDTA(pH ）， ，避光保存于室溫。在含有甲醛的凝膠上進行的RNA電泳甲醛蒸氣有毒，含有甲醛的溶液應在化學通風櫥內配制，裝有甲醛溶液的電泳槽應盡可能蓋嚴。3 RNA的洗滌與溶解吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗滌沉淀，4℃，7500g離心5分鐘。按1 ml ml氯仿，震蕩15秒，室溫放置3分鐘，12000g，4℃離心15分鐘。實驗內容材料 小鼠新鮮肝試劑 總RNA提取純化試劑：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，無水乙醇，已丙醇；電泳試劑：MOPS，甲酰胺，甲醛，上樣緩沖液（50%甘油，10 mM EDTA，% 溴酚藍，%二甲苯青），瓊脂糖。在加入氯仿離心后，RNA保留在水相中，與DNA和蛋白質分離開來（保留在有機相中）。實驗十一 RNA的提取及其純度檢測實驗目的： 了解Trizol提取總RNA的原理，掌握高質量完整總RNA提取的技術以及電泳變性膠電泳檢測和濃度及純度鑒定方法。4. SDS很容易漂浮在空氣中而吸入體內，稱量時最好在通風櫥中進行，或戴上口罩。2. 凝固后一般不再有毒性，但考慮到存在沒有完全交連的分子，實驗結束后不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗510分鐘。5. 對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，同樣也須1000C處理 3～5min。 3．鹽濃度應盡可能低，可用SephaderG25快速脫鹽；鉀離子(K+)要除去，因為鉀離子沉淀SDS。 電泳樣品的準備1．濃度 單一成分1—10μg，若濃度太稀，應沉淀后再進行電泳；對于非單一成分的樣品，如基因工程大腸桿菌的表達產(chǎn)物，其蛋白量50～100μg可取得較好的分離效果。 3．上樣孔是否平齊，若上樣孔不平齊，也影響蛋白電泳的遷移率。影響蛋白質電泳分離效果的因素 1．蛋白質樣品中的鹽濃度 影響蛋白條帶的遷移率和帶型，因此為消除鹽濃度的影響，溶解蛋白時最好用去離子水，再加等量2SDSPAGE樣品緩沖液，必要時經(jīng)過透析或進行Sephader G25過柱。13 染色1小時14 脫色至條帶清晰，背景明亮為止。11 取50ug蛋白上樣，加入5ul上樣緩沖液，沸水浴5分鐘，瞬時離心后上樣。按下表制備濃縮膠水30%丙烯酰胺溶液／L TrisHCl pH 10％SDS10％APTEMED按下表制備分離膠9 超聲處理5分鐘，每30秒間隔50秒，12000rpm離心10分鐘，取上清作為蛋白樣品。7 加入30ul的 10mg/ml的溶菌酶，充分懸浮，4度放置2小時以上。5 ，5000rpm離心1分鐘，收集細菌。4 表達載體和重組載體都分別設置誘導組與不誘導組，誘導組加入終濃度為1mM的IPTG，不誘導組不加IPTG。4度放置過夜。甲醇400m1冰乙酸100ml考馬斯亮藍R2501gddH2O加至1000m1脫色液甲醇400ml冰乙酸100mlddH2O500ml操作步驟1將凍存的含有組表達載體pETB1, 空表達載體pET28b的大腸桿菌BL21畫線接種在LB平板上，37度培養(yǎng)過夜，直至平板上長出單菌落。Tris甘氨酸電泳緩沖液，可配成5貯存液備用，臨用前稀釋。10％過硫酸銨(AP，新鮮配制)。TrisHCl， 1．5mol／L／L Tris—HCl，pH 。實驗內容材料：含有重組表達載體pETB1, 空表達載體pET28b的大腸桿菌BL21。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的SDS多肽復合物全部濃縮于極小體積的能力，從而提高了分辨率。 聚丙烯酰胺凝膠電泳由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N，N′—亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下，形成三維網(wǎng)狀結構。不同的蛋白質分子具有不同的電荷和分子量。沒有加入IPTG誘導劑的時候，lacI 產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac 操縱基因結合，從而不能進行外源基因的轉錄和表達，而只有表達載體隨大腸桿菌的增殖和復制；當加入IPTG后，阻遏蛋白不能與操縱基因結合，則DNA外源基因大量轉錄并高效表達?！舅伎碱}】1． 什么是星號活性？2． DNA的酶切實驗要注意那些問題？3． 雙酶切的緩沖液應滿足什么條件？如何解決？4． 使用EB時應注意什么問題？5． 在做瓊脂糖凝膠電泳時應注意什么問題？【課外閱讀】大連寶生物公司限制性內切酶說明書.美國New England biolabs公司說明書,網(wǎng)站:11實驗十 外源基因在大腸桿菌中的表達及其檢測實驗目的了解IPTG誘導的外源基因在大腸桿菌中的表達的原理，掌握外源基因在大腸桿菌中的表達及其檢測技術。不同的酶使用不同的反應液,不能選擇合適的反應液時,先使用低鹽反應液,加入相應的酶,然后補加一定的鹽離子和對應的酶.3. 盡可能地降低反應總體積，增大酶與底物間的碰撞機會，增加反應速度。注意事項1. 酶切反應的影響因素很多，操作時首先要保證質粒DNA的純凈，樣品中過高的鹽分和痕跡量的酚等都會使酶切反應無法正常進行。注意：長度以兩個電極之間的距離計算。電泳樣品為：酶切樣品；酶切前的對照樣品；分子量參照物(18)接通電源，DNA樣品往正極移動。(16) 在DNA樣品中加入1／10的上樣緩沖液并混勻。(14) 取掉模具兩端的膠布，放入電泳槽，加樣孔在負極端。室溫下15～30min后，瓊脂糖溶液完全凝固。(11) 凝膠冷至60℃左右，／m1。 電泳（9） g瓊脂糖，加入100ml 1TAE電泳緩沖液中。 (7) 37℃，1h。 I單酶切。(4)分別加入pNTEEGFP質粒DNA。 (2)。(9)10溴酚藍上樣緩沖液。(7)DNA分子量參照物（marker）。(5)瓊脂糖。(3)無菌水。進行雙酶切后將得到2條片斷，一條和空質粒大小一致的片斷令一條與插入片斷一樣大。 (二)酶切鑒定重組質粒當空質粒載體的多克隆位點插入外源DNA片斷后，可以利用插入兩端的限制性內切酶進行酶切對外源片斷的重組進行鑒定。（3）如果兩種酶對鹽離子濃度要求不同，則要求低鹽的酶先消化，要求高鹽的酶后消化，具體方法是：在低鹽緩沖液中加入第一個酶，反應結束后，補加1/10體積的高鹽緩沖液，加入第二個酶再消化，或第一個反應結束后抽提DNA，再用高鹽緩沖液酶切。雙酶切時需要注意以下幾點：（1）如果所用兩種酶的反應條件完全相同（溫度、鹽離子濃度等）那么，可以將它們同時加到一個試管中進行酶切。如果DNA濃度很稀，加入反應系統(tǒng)中的體積要增大，這時TE中的EDTA將會與酶的激活因子螯合，影響酶切效果。這時為了酶的用量體積不超過反應總體積的10％，其酶切反應體積不可能保持到最小。但是，酶切反應混合物中甘油的含量不能超過5％，否則將會抑制酶的活性(通常將酶量控制在反應總體積的1／10以下)。根據(jù)酶解DNA的數(shù)量，按比例適當放大體積。 至于酶的用量，一般的做法是控制在1U酶在15—20μl中酶解1μgDNA，但具體地分析應該對不同的DNA，酶的用量有所不同，如EcoR I酶對4．3kb的pBR322有一個切點， 6有兩個切點，如果不考慮其他構型的影響，：1(酶單位)。并且每經(jīng)一步操作后，都要取一定量的DNA樣品進行電泳鑒定或作為電泳對照樣品。設計酶解DNA的數(shù)量時，除了根據(jù)連接與轉化的要求外，還要按照DNA濃度的高低，酶液單位的高低等具體情況而定。EDTA螯合了反應系統(tǒng)中所有的二價陽離子，就更便于終止酶切反應。當保存在10％甘油中時，酶活力喪失更快。EcoR I酶置65℃水浴中，保溫10min，喪失95％的酶活性。一般來說，如酶的純度不佳，酶切時間不能太長。如果鹽離子濃度使用不當，會使酶的識別位點發(fā)生改變，例如當鹽離子濃度低于50mmol／L時，EcoR I內切酶的專一性就降低，只能識別中間的4個核苷酸序列(稱該酶為EcoR I*)。不同酶切反應都需要Mg2+并要求一定的鹽離子濃度，但不同的酶達到最佳酶切效率所需的鹽濃度不同。實驗原理(一)酶切 各種限制性內切酶能專一地識別堿基順序，例如，EcoRⅠ酶的識別順序為：GAATTC；Scal I酶的識別順序為：AGTACT，用EcoR I和Scal I同時酶解含有這兩個單一酶切位點的環(huán)狀雙鏈DNA分子，就產(chǎn)生兩條帶有相應酶切位點的線性DNA分子。+對Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時按照試劑商提供的說明擴增不出目的基因時，不妨適當增加Mg2+的濃。如果得到與插入片段大小一致的片段，說明已經(jīng)成功重組。）7 取10μl PCR反應液及1μl上樣緩沖液混合，進行1% 瓊脂糖電泳(5V／cm)，選擇適當大小的DNA分子量標準（DL2000），檢查擴增產(chǎn)物。94℃變性3min，94℃45秒，64℃ 1分鐘，72℃3分鐘，20個循環(huán)。，按下列順序加樣，建立20μl反應體系。2 12000rpm 離心2分鐘。實驗內容儀器和試劑1．儀器 PCR儀，微型水平電泳槽，電泳儀，水浴鍋，離心機等。理論上，經(jīng)過n次循環(huán)可使特定片段擴增到2n1，考慮到擴增效率不可能達到100％，實際上要少些，通常經(jīng)25～30次循環(huán)可擴增106倍，這個量足夠分子生物學研究的一般要求。PCR反應由一系列的變性——退火——延伸反復循環(huán)構成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。實驗原理 PCR(polymerase chain reaction)是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。3 純化樹脂（于GS結合液中）為灰褐色粉狀物質，靜置時沉淀于瓶底，使用時要充分混勻。注意事項1 低熔點膠回收DNA時，切除不含樣品的凝膠，保證樣品凝膠盡可能地要小。l電泳（%瓊脂糖，120V，10分鐘）檢測并目測定量。TE緩沖液或超純水的用量視用戶對濃度的要求而定。放置2分鐘后，13,000rpm離心30秒。l TE緩沖液（若用于測序，則加40181。重復第4步一次，此步驟13