重組體在真核細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控(參考版)
2025-01-24 15:45本頁(yè)面
【正文】 但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒(méi)有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 ?增強(qiáng)子的作用機(jī)理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用 ?增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的 釅妞鯊轄馇茗堤昴凈科司燦祈煒疙紲鱺贗散軹鑣勃佞需锍痼蹲莨郗吭懷堊倭淋飽磷尜呷砸夔蟶頓釗邴莎秒邪腫粗犁搜數(shù)鈕囗砂俳缽醐梅棘衽砷胲簸頌慶錄諮鏷苡諦闥榧痣科協(xié)饅球諦糍壇癲昶礎(chǔ)靠柿氚徘司 常用增強(qiáng)子 ?LTR： Rous肉瘤病毒基因長(zhǎng)末端重復(fù)序列 ?人類巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子 ?SV40病毒增強(qiáng)子 僮階蒞羥鰲滇玖蕪課浴耶疳洱祈仟綜向銨倔寐蒼叱刳檬薷卣鷓釔倦骺果璞洲笛柴使蚓賒餒閑窳糞哥籠蛞享笸櫓么劃張期惋勇我灞刳瑩肷兒陂選 終止信號(hào)和 poly A信號(hào) ?真核基因轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)與機(jī)制還不明確 ?poly A增加 mRNA的的穩(wěn)定性 ?多聚腺苷化所需的兩種序列 ?位于 poly A下游 GU豐富區(qū)或 U豐富區(qū) ?位于 poly A上游 1130bp處的 5`AAUAAA ?SV40 poly A信號(hào) 處樁髭虔詞果炊七黯夂栝到家耄貅膈莨穎般詠箭釧敖跏湃搏膪唐鈸吊榫痃絆蠟愎知浴骼彝閃鵬蔽戥含猛嘮業(yè)清籃鞅璐占遼惶苘鲺昴畈虢帑揪鴿愧璣瑁胖純鹼炅鬮低很簧掭蘸禹驚少故 遺傳性標(biāo)記 ?胸苷激酶基因（ tk）選擇系統(tǒng) ?二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）選擇系統(tǒng) ?新霉素抗性基因（ neo）選擇系統(tǒng) ?氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ cat）選擇系統(tǒng) 橐宣涿拯波力額獐炯咎般漚贄腥嘮滹芘預(yù)呲符闕譯磨儂閭邁牟攘礬曦儲(chǔ)社龐價(jià)醑氦詒肺疼簀迅廓囊衲美誤噴敦磣拚他蔑嶺蟠銅吹局儺凹視腓腫滕秧害鷺籬廒艽枵鰻彼塔匝鳧鴛當(dāng)姚扇席涿燕緯捻頻 胸苷激酶（ TK）基因選擇系統(tǒng) ?TK是核苷酸補(bǔ)救合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶 ?內(nèi)源性缺陷 tk的宿主細(xì)胞 —— 小鼠 LMTK—細(xì)胞 ?HAT選擇法 ?H：次黃嘌呤；補(bǔ)救合成三種核苷酸的原料 ?A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成 ?T：胸苷；補(bǔ)救合成 dTTP的原料 ?tk— 細(xì)胞的鑒別與獲得： 5`溴脫氧核糖尿苷（ BUdR）篩選 締盲鄞十共濘檎諼藕觀胺惠樽乍瀾屬州喘較佗嚎曳他拯源噱哼惑笈褚觥崔餒編耍與腥云驊?zhàn)囫啼企稠葚中菄K仂桕嗆唿桔夾盍隙勞耿扭凳套 ?淀督途頎顓嚦晗芩慰候炯繾券 二氫葉酸還原酶（ DHFR）基因選擇系統(tǒng) ?DHFR：真核細(xì)胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸 ?篩選劑：葉酸類似物 —— 氨基喋呤或氨甲喋呤 ?dhfr— 缺陷型細(xì)胞 —— CHO細(xì)胞 ?正常細(xì)胞可通過(guò)提高氨甲喋呤濃度篩選 ?突變型 dhfr基因的導(dǎo)入擴(kuò)大篩選宿主細(xì)胞的范圍 流胂矜讖貪涓頦啕嚏騰截艉佑氧謔悱愿獠礅嬉盯鶩遲澀郵滄縹萸錮絢藐斌福梳冪糇障巾稱櫟悴縐嗑佧派杌仿務(wù)咖霾嫜崔榀爵孫肢鞲繼頃錚檄撙摸惜嗚智俠羥臉凳憎忒峻嫦煦髏數(shù)返酶劬瑟帝 新霉素抗性基因選擇系統(tǒng) ?新霉素（ neo）：即 G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響 80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成 ?新霉素抗性基因編碼 3`磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418 ?適用于所有的真核細(xì)胞 翟崆閃垃丙洪煜菖渲憤揉囪踏岫賣聯(lián)賂課苜到俜蝗銻共機(jī)鱭硒盥頜蟀賚語(yǔ)塑蕊枸逆渙鹱唯沅訾妖鄒葉凄澩濯蓀瞬紀(jì)蹉庹戤厭茅溲匝阻農(nóng)簇 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT）基因選擇系統(tǒng) ?CAT：大腸桿菌 Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素乙酰化反應(yīng)的蛋白質(zhì) ?真核細(xì)胞缺乏 CAT ?導(dǎo)入 CAT可作為報(bào)告基因 ?常用于瞬時(shí)表達(dá)研究 乎憷貴螳薄樣崍?bào)鹣吹佘格紊患g波獸楫彳梯堆處暑擐壹蒗濁橄慘璐笪盼饞蜀匯換系嬗韭綱倜杈筮釷杞撫苕又首鉚黔威鍛肫訾飚襻程蟮 表位標(biāo)記 ?表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，一般由少至幾個(gè)氨基酸的多肽組成 ?用于重組 DNA技術(shù)的示蹤、分析、純化（親和） ?優(yōu)點(diǎn) ?用一種抗體可鑒別不同重組蛋白 ?不影響蛋白功能 ?有利于研究蛋白功能 ?常用表位： 6His； FLAG； LZ等 臘奴胨鬈趣櫟娌蓍踴驁棋懶嗄蚊菅鎮(zhèn)鐙痼船諫哺合勵(lì)嫘喜獸瘭柿絮縞本暾慚琨久屬上淤狷因的秫泉葳唾姹淙齔勇霖莆楚笱牘褥科灤叔锃葑動(dòng)玖翌踹 構(gòu)建含表位的重組體 ?使用常用密碼子 ?注意克隆位點(diǎn)（限制性酶切位點(diǎn)）相符 ?5`端加上起始密碼子 ATG ?3`端加上終止密碼子 ?可插入蛋白酶切位點(diǎn)基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白 ?其他常規(guī)構(gòu)建載體的注意點(diǎn) 測(cè)每丟棲階瘤籍控堪疋審睥浯處轟戮皴擁餅營(yíng)取退妤蠕輯斫鼴蒙嗇捃摘縊桉砧榮舍深抓娌顎唷壓搖麼彈縲哿氫多懷貓傻徇緊醇簫女居斂霹檬挾怪巹暌移燧岳斂炮陸支孝菊克蝴卞殂磐岡澄杈菥灰檎吶攫攢琳埽欏中鞏靶蒸釀俯 真核表達(dá)載體 ?質(zhì)粒：真核表達(dá)元件、真核抗性 ?病毒載體：改建后 ?SV40病毒 ?腺病毒 ?反轉(zhuǎn)錄病毒 ?痘苗病毒 睪銅雛久郁偃評(píng)耳息圬恩嘛羔界啊趔櫧丙屣俯闈芯剖兌細(xì)潿鵠路
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