微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制(參考版)
2025-01-16 23:46本頁(yè)面
【正文】 (2)用遺傳選擇去阻遏：包括選擇不會(huì)受到產(chǎn)物阻遏的突變株。 ①代謝途徑產(chǎn)物的阻遏可通過(guò)限制產(chǎn)物的積累而降低。抑制可由終產(chǎn)物、中間產(chǎn)物或偶爾由底物所造成。 此法不僅排除了壁通透性障礙，并且保全整體細(xì)胞內(nèi)酶體系來(lái)進(jìn)行研究，不像無(wú)細(xì)胞抽提法用破碎細(xì)胞而損壞了酶體系，使某些需偶聯(lián)的酶反應(yīng) (如氧化還原反應(yīng) )來(lái)進(jìn)行生物合成就不能得到結(jié)果。從分析產(chǎn)生菌和突變株代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，找出這些代謝產(chǎn)物在合成中的相互關(guān)系，就可推斷其生物合成反應(yīng)步驟，再分離反應(yīng)中的特殊酶類(lèi)，又可判斷其生化反應(yīng)特性。 將產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，使其失去生成產(chǎn)物或某步中間體的能力，就可分離到生物合成中的各種不同障礙突變株， 即所謂負(fù)突變株。 近年來(lái)從頭孢菌 Cephalosporium caeruleus中分離到一種能抑制脂肪酸生物合成中縮合酶 (3oxoacylACPsynthase)的淺藍(lán)天菌素Cerulenin，它使乙酰載體蛋白 (Acyl carrier protein， ACP)與丙二酰 ACP不能縮合成乙酰乙?；?ACP，故也阻止了聚乙酰體生物合成途徑，因此可作為研究聚乙酰體 (Polyketide)途徑所產(chǎn)生天然產(chǎn)品生物合成工具。檢測(cè)反應(yīng)體系中的底物和產(chǎn)物濃度，判斷該酶是否催化目的產(chǎn)物的生物合成。這種酶制品往往含有多個(gè)酶體系，為了排除其他酶對(duì)某一種酶反應(yīng)的干擾，進(jìn)一步分離純化制得純酶。通常采用無(wú)細(xì)胞抽提液來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 重要缺點(diǎn) 為了確定同位素的結(jié)合位置 ,還需將產(chǎn)物進(jìn)行一系列的降解 ,分離和測(cè)定等大量工作 . 應(yīng)用此方法時(shí)應(yīng)注意兩點(diǎn) 一是 示蹤物質(zhì)雖然是目的產(chǎn)物生物合成的前體物質(zhì)，但由于不能通過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞而不能被結(jié)合到產(chǎn)物的分子中，將其錯(cuò)誤地認(rèn)為不是前體物質(zhì)； 二是 雖然在目的產(chǎn)物中檢測(cè)到了示蹤物質(zhì)，但實(shí)際是示蹤物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)被降解，真正結(jié)合到目的產(chǎn)物分子的是示蹤物質(zhì)的降解產(chǎn)物。 (5)同位素標(biāo)記法 同位素標(biāo)記法是確定構(gòu)成目的產(chǎn)物分子“構(gòu)建元件”的好方法 ,即應(yīng)用同位素合成起始物和中間體進(jìn)行喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 。有的試驗(yàn)化合物，雖然確實(shí)是產(chǎn)物合成途徑中的前體，但因受細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性的障礙或通過(guò)時(shí)受細(xì)胞壁與細(xì)胞膜上酶的作用而引起分子降解或發(fā)生立體構(gòu)型的改變等，使這類(lèi)討論中得到了負(fù)的結(jié)果。 (4)互補(bǔ)共合成 (cosynthesis)法 應(yīng)用兩株生物合成阻斷變株，當(dāng)它們單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)均不能產(chǎn)生目的代謝產(chǎn)物，而將它們進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)獲得目的產(chǎn)物或者以后某一步中間體，來(lái)證明生物合成所經(jīng)過(guò)的途徑，或證明生物合成途徑中確實(shí)存在某個(gè)中間體，通過(guò)分別提取、分離和鑒別阻斷變株積累的中間體和共合成的產(chǎn)物，了解它們的阻斷部位和順序以及反應(yīng)過(guò)程，推斷目的產(chǎn)物的生物合成途徑。 (3)阻斷變株法 (block strains) 將次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變處理，篩選出失去產(chǎn)生某種目的代謝產(chǎn)物能力的突變株，即生物合成的阻斷變株。為避免菌體內(nèi)含物的干擾，常把洗凈后的菌體懸浮于生理鹽水中，保溫一定時(shí)間，盡可能使其內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)耗盡，然后再在人工培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn) ,即饑餓后實(shí)驗(yàn) 。 (2)洗滌菌絲懸浮法 或稱(chēng)靜息細(xì)胞法 目的 :為了排除原培養(yǎng)基自身的代謝物對(duì)不同生長(zhǎng)階段的影響， 簡(jiǎn)化代謝物生物合成的研究系統(tǒng)和區(qū)別試驗(yàn)化合物的作用，常借用洗凈的靜息菌絲體，此時(shí)菌體不在分裂過(guò)程中，但仍有代謝活力。 研究方法 喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)法或稱(chēng)刺激試驗(yàn) 洗滌菌絲懸浮法 或稱(chēng)靜息細(xì)胞法 阻斷變株法 互補(bǔ)共合成法 同位素標(biāo)記法 無(wú)細(xì)胞抽提液法 ) 酶抑制劑法 遺傳特性誘變法 原生質(zhì)體試驗(yàn)法 去阻遏方法 (1)喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)法（或稱(chēng)刺激試驗(yàn)） 在發(fā)酵的培養(yǎng)基中，加入某些可能是前體的物質(zhì)，觀察該物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中的利用情況與促進(jìn)目的產(chǎn)物生成的效果。 論證生物合成途徑的一般步驟為： ①確定構(gòu)成目的產(chǎn)物的構(gòu)建單位即生源； ②確定生物合成途徑中的關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，合理地推斷反應(yīng)順序； ③分離鑒別生物合成反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。 4． 5 研究微生物藥物生物合成 機(jī)理的主要方法 微生物藥物生物合成機(jī)理的研究包括細(xì)胞內(nèi)將一種或幾種初級(jí)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為次級(jí)代謝終產(chǎn)物的反應(yīng)順序，以及該反應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。 次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵過(guò)程需要適量的溶解氧，溶解氧的降低影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。 另外有些金屬離子 (如 Mg2+和 Ca2+等 )可以解除產(chǎn)生菌 (卡那霉素、新生霉素和鏈霉素等產(chǎn)生菌 )對(duì)所產(chǎn)抗生素的特異性吸附作用，使抗生素從菌絲上游離下來(lái)，促進(jìn)產(chǎn)物分泌。 11金屬離子和溶解氧的調(diào)節(jié) 在多數(shù)情況下，微量的金屬離子是參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶的活化因子，甚至有時(shí)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平上起作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，變異株細(xì)胞膜攝取合成新生霉素所需氨基酸的能力大大降低。 又如，
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