【正文】 51 非競爭性抑制作用在 LineweaverBurk圖上能識別，因為它提高實驗的直線斜率，改變在 y軸上的截距 (因為Vmax降低 )，而 x軸上的截距不變 (因 Km維持不變 )[圖 114(c)]。在非競爭性抑制作用中，酶對底物的親和力不變，因此 Km保持一致。 49 162 六、可逆的非競爭性抑制 ? 非競爭性抑制劑可逆地結(jié)合到除 酶活性部位外的其他位點上 [圖 114(a)]，它使酶總的三維形狀改變，導(dǎo)致催化活性降低。競爭性抑制作用可用LineweaverBurk圖加以識別，把抑制劑的濃度固定，測定不同底物濃度下的 Vo。該酶以琥珀酸 (succinate)為底物，它可被丙二酸(malonate)競爭性地抑制，后者與琥珀酸的區(qū)別是只有一個而不是兩個亞甲基 (圖 113)。因此酶的 Vmax沒有變化，但在競爭性抑制劑存在下，酶對其底物的表觀親和力降低，因此 Km增加。競爭性抑制劑可逆地結(jié)合到活性部位。 160 五、可逆的競爭性抑制 ? 典型的競爭性抑制劑與酶的正常底物有近似的結(jié)構(gòu)，因此它與底物分子競爭地結(jié)合到活性部位 [圖 112(a)]。 ? 碘代乙酰胺修飾 Cys殘基，因此，確定酶活性所必需的 Cys殘基是一個或多個作為判斷工具 [圖 111(b)]。 ? 敏感的氨基酸殘基包括 Ser殘基和 Cys殘基具有相應(yīng)的活性的一 OH和一 SH基。 ? 從酶中去除抑制劑能夠制止可逆抑制作用，例如使用透析，但這是有限度的，對不可逆抑制作用則是不可行的。酶抑制作用具有以下兩種主要類型： ? 46 157 酶抑制作用具有兩種主要類型： ? 不可逆的 (irreversible)或可逆的 (reversible)。其他抑制劑可以是外源物質(zhì)，如藥物式毒物。任何分子直接作用于酶使它的催化速率降低即稱為 抑制劑(inhibitor)。 155 例外！ 雖然米 曼氏模式對許多酶提供了很好的實驗數(shù)據(jù)模式，但有少數(shù)酶與米 曼氏的動力學(xué)不相符合，如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase)，這些酶稱為變構(gòu)酶 (allosteric enzyme)。 44 154 二、 LineweaverBurk作圖 ? 因為 Vmax是在極大的底物濃度下獲得的，它不可能從雙曲線圖測得 (Km也是如此，見 圖 l10(a))，但是 Vmax和 Km可用實驗求得，即在不同底物濃度下測定 Vo值，然后即可根據(jù) 1／ Vo對 l／ [S]的雙對數(shù) (double reciprocal)或LineweaveBurk制圖 [圖 l10(b)]，此種作圖是從米 曼氏公式衍生得出的： 45 由此公式得出一條直線，在 y軸上截距等于 1／ Vmax， x軸上截距等于 1／ Km直線的斜率等于 Km／ Vmax[圖 110(b)]。 ? 高的 Km表示弱的底物結(jié)合 (k2大大超過 k1)，低的 Km表示強底物結(jié)合 (k1大大超過 k2)。在這些情況下 Km變?yōu)槊笇λ牡孜锏?親和力 (affinity)的量度。Michaelis 和 Menton在推導(dǎo)此公式時，規(guī)定一新的常數(shù)即 Km，稱為米氏常數(shù) (其單位與物質(zhì)的量濃度相同，用 mol/L)： 返回 45 153 Km？ ? Km是 ES復(fù)合酶的穩(wěn)定性的量度，等于復(fù)合物的分解速率的總和，它大于生成速率。 152 43 返回 42 米 曼氏推導(dǎo)的公式描述出實驗觀察的結(jié)果。對許多酶的性質(zhì)的觀察得知，在低的底物濃度 [S]下，起始速度 (Vo)直接與 [S]成正比， 而在 高底物濃度 [S]下，速度趨向于最大值，此時反應(yīng)速率與 [S]無關(guān) [圖 l10(a)]。 ES復(fù)合物能重新解離形成 E+S，或能繼續(xù)進行化學(xué)反應(yīng)形成 E和產(chǎn)物 P。 150 第五節(jié) 酶動力學(xué)和抑制作用 一、米 曼氏模式 42 米 —曼氏模式 (MchaelisMentonton model)使用如下的酶催化概念： 這里速率常數(shù) (rate constants)k k2和 k3是描述與催化過程的每一步相聯(lián)系的反應(yīng)速度。 41 返回 149 ? 許多酶的最適 pH在 ，但是各種酶的最適 pH是多種多樣的，因為它們要適應(yīng)不同環(huán)境進行工作。 pH發(fā)生較大偏離時，維護酶三維結(jié)構(gòu)的許多 非共價鍵 受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白自身的變性。 148 七、 pH ? 每個酶都有最適 pH，在此 pH下催化反應(yīng)的速率是它的最高值。 ? 多數(shù)哺乳動物的酶，其最適溫度為 37℃ 左右，但也有些生物機體的兩適應(yīng)在相當高或相當?shù)蜏囟认鹿ぷ鳌? 40 147 ? 升高溫度 以提高反應(yīng)速率的總效應(yīng)是這兩個相反效應(yīng)之間的平衡。 ? 這些相互作用維系著整個酶的三維結(jié)構(gòu)，最終將導(dǎo)致酶的 變性(伸展 unfolding)。 ? 首先，升高溫度增加底物分子的熱能 (thermal energy)，增高反應(yīng)的速率。 Vo與酶濃度的關(guān)系圖為直線圖形。 38 145 五、酶濃度 在底物濃度飽和的情況下 (即所有酶分子都與底物結(jié)合 )，酶濃度的加倍將導(dǎo)致 V。 V。的微小變化。 144 四、底物濃度 酶速度對底物濃度 ([S])的依賴關(guān)系的正常模式是，在低的底物濃度下， [S]增加 1倍，將導(dǎo)致起始速度 (Vo)也增加 1倍。 ?比活力是每毫克蛋白質(zhì)中酶單位的數(shù)量 (U／ mg)。 mol／ min＝ l U＝ nkat換算。 ? “ 開特 ” 是酶活力的國際單位 (sⅠ) ，它規(guī)定在特定體系下，反應(yīng)速度為每秒轉(zhuǎn)化 1mol底物所需的酶量 。 ? 酶的 1個活力單位是在該酶的最適條件下，在 25℃ ， 1 min內(nèi)催化 1181。mol／ min)。 142 ? 酶活力單位 (enzyme units)可以用許多方式表示。還因為酶可能受到它本身產(chǎn)物的反饋抑制 (feedbackinhibition)和 /或包括逆反應(yīng)，而且反應(yīng)產(chǎn)物將刺激逆反應(yīng)。mol／ min)，因為產(chǎn)物尚未出現(xiàn)，在這點上速率是最快的。酶速度通常記錄為時間為零時的值 (V。這可保證有色色素原的產(chǎn)生速率與 H2O2的產(chǎn)生速率成正比，它的產(chǎn)生又與葡萄糖氧化酶的活力成正比。但是，在此反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫能被第二種酶 ——過氧化物酶作用，并把一個無色化合物轉(zhuǎn)化為有色化合物 ——色素原 (chromogen)，它的光吸收能容易地進行測量。在這種情況下測定催化此反應(yīng)的酶，將其與第二個具有特殊吸收光變化的酶反應(yīng)相連接 (linking)(或偶聯(lián) coupling)，通常是可行的。 ? 一個實例是乳酸脫氫酶，以乳酸作為底物的活力可依據(jù)下示方程，用隨之增加的 340 nm的光吸收進行測定。 ? 它們在紫外光 (UV)區(qū)的吸收波長為 340 nm，因此，如果NADH或 NADPH在反應(yīng)過程中產(chǎn)生，那么在 340 nm的光吸收將相應(yīng)地增加。因為光吸收與濃度成正比例，光吸收改變的速率與酶活力，即每單位時間底物用去的物質(zhì)的量 (或產(chǎn)物形成的物質(zhì)的量 )成正比。 如果底物 (或產(chǎn)物 )在特殊波長下吸收光，根據(jù)它們在此波長下吸收光的變化即可測得這些分子的濃度變化。因此， 一般要求非常高的底物濃度 以使實驗測定的起始反應(yīng)速率與酶濃度成正比。對哺乳動物的酶，最適溫度通常在 25～ 37℃ 。 為了測定酶 (檢測酶的活性 )必須了解催化反應(yīng)總的反應(yīng)式，而且分析程序必須能夠測定底物的消失或產(chǎn)物的生成。 ? 此外，酶的區(qū)室化 (partmentationn)和多酶復(fù)合體等都和酶活力的調(diào)節(jié)控制有密切關(guān)系 。 31 135 ? 能荷的數(shù)值是 0～ 1，當腺苷酸全部以 AMP的形式存在時，能荷數(shù)值等于 0；全部以 ATP形式存在，能荷數(shù)值等于 1。 ? 另一些酶需要 Na+活化， K+起抑制作用，如腸中的蔗糖酶可受 Na+激活，二價金屬離子如 Ca2+、 Zn2+ 、Mn2+ 、 Mg2+ 往往也為一些酶表現(xiàn)活力所必需，它們的調(diào)節(jié)作用還不很清楚，可能和維持酶分子一定的三級、四級結(jié)構(gòu)有關(guān)，有的則和底物的結(jié)合和催化反應(yīng)有關(guān)。 ? 再如合成嘧啶核苷酸時．終端產(chǎn)物 UTP(尿苷三磷酸 )和CTP(胞苷三磷酸 )可以控制合成過程一連串反應(yīng)中的第一個酶。 ? 例如，異亮氨酸可抑制其合成代謝通路中的第一個酶 ——蘇氨酸脫氨酶。催化此物質(zhì)生成的第一步反應(yīng)的酶，往往可以被它的終端產(chǎn)物所抑制，這種對自我合成的抑制叫 反饋抑制 。 30 。 132 5．抑制劑的調(diào)節(jié) 酶的活性受到大分子抑制劑或小分子抑制劑抑制，從而影響活力。 免疫球蛋白對外來異物有 “ 識別 ” 結(jié)合作用和激活補體作用。在凝血酶作用下，收縮成血塊，使破損的血管封閉而修復(fù) 。 130 血液凝 固 ?血液凝 固 是由體內(nèi)十幾種蛋白質(zhì)因子參加的 級聯(lián)式酶促激活反應(yīng) ，其中大部分為 限制性蛋白水解酶 。 129 酶原激 活 ? 酶原激活 是指體內(nèi)合成的 非活化的酶前體 ，在適當條件下，受到 H+或特異的蛋白酶限制性水解，切去某段肽或斷開酶原分子上某個肽鍵而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘拿?。細胞?nèi)合成的新生肽大都以無活性的前體形式存在，一旦生理需要，才通過限制性水解作用使前體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘牡鞍踪|(zhì)或酶，從而啟動和激活以下各種生理功能，如酶原激活、血液凝固、補體激活等。 ? 例如，磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化；大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酸化和去腺苷酸化就是以這種方式調(diào)節(jié)它們的活性。在一種酶分子上，共價地引入一個基團從而改變它的活性。妊娠時，修飾亞基在乳腺生成，分娩時，由于激素水平急劇的變化，修飾亞基大量合成，它和催化亞基結(jié)合，大量合成乳糖。修飾亞基和催化亞基結(jié)合后，改變了催化亞基的專一性，可以催化半乳糖和葡萄糖反應(yīng)生成乳糖。如乳糖合成酶有兩個亞基，催化亞基和修飾亞基。例如，在分解代謝中， β 半乳糖苷酶的合成，平時是處于被阻遏狀態(tài)，當乳糖存在時，抵消了阻遏作用，于是酶受乳糖的誘導(dǎo)而合成。酶活性的調(diào)節(jié)控制主要有下列 7種方式。 124 高度專一性 酶催化 專一性 作用機 制假說 鎖鑰假說 誘導(dǎo)契合假說 125 三、調(diào)節(jié)性 ? 生命現(xiàn)象表現(xiàn)了它內(nèi)部反應(yīng)歷程的有序性。 雖然尼克酰胺環(huán)上的 C4既 非不對稱碳 ，也 非順反異構(gòu)特征 ，但脫氫酶卻都能專一地識別并作用這個碳原子上兩個氫中的一個。以延胡索酸水合酶催化延胡索酸生成蘋果酸為例，在 3H20溶液中， 3H以立體專一性方式加入到底物上 (圖 16)。 ? 對那些已知立體結(jié)構(gòu)的脫氫酶，如肝乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、甘油醛 3磷酸脫氫酶，其專一性機制已經(jīng)搞清。以NAD+和 NADP+為輔因子的脫氫酶為例，用適當標記的底物做實驗，發(fā)現(xiàn)脫氫酶催化底物上的氫轉(zhuǎn)移到尼克酰胺環(huán)特異的一面，稱為 A型脫氫酶 和 B型脫氫酶 (圖 15)。 現(xiàn)已知道有 400多種不同專一性的這類酶，雖然酶對含有合適序列的任何 DNA分子或片段都能作用，但 每一個酶的活性中心接觸底物的特定區(qū)域具有絕對的專一性 。 119 基團專一性和絕對專一性對低分子量的底物來說容易理解。 25 118 ? 具有 中等程度專一性的為 基團專一性 ，如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化。 ? 例如它們可分別作用肽、磷酸酯、羧酸酯。 114 ++++++++++++++++++++++ 24 返回 115 二、專一性 116 高度專一性 酶對它所作用的底物有嚴格的選擇性，一種酶只能 催化某一類，甚至是某一種物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng) 酶的專一性 底物專一性 反應(yīng)專一性 立體異構(gòu)專一性 (手性、區(qū)域 ) 從根本上保證了生物體內(nèi)為數(shù)眾多的各種各樣的化學(xué)反應(yīng)能有條不紊地協(xié)同進行 117 ? 大多數(shù)酶對所作用的底物和催化的反應(yīng)都是高度專一的。以固氮酶為例， NH3的合成在植物中通常是 25℃ 和中性 pH下由固氮酶催化完成，酶是由兩個解離的蛋白質(zhì)組分組成的一個復(fù)雜的系統(tǒng)，其中一個含金屬鐵，另一個含鐵和鉬，反應(yīng)需消耗一些 ATP分子，精確的計量關(guān)系還未知。 ? 在其他可比較的反應(yīng)中，酶促反應(yīng)速度相當高，而反應(yīng)溫度可能很低。對那些可比較的反應(yīng)，可發(fā)現(xiàn)反應(yīng)速度大大加速(見下 例 )。 22 110 酶催 化作 用的 特點 加快反應(yīng)速度 降低反應(yīng) 的活化能 不改變 反應(yīng)性質(zhì)