【正文】 10:55:48 上午 10:55 上午 10:55:48三月 21MOMODA 三月 21三月 2110:55:4810:55:48March 24, 20231意志 堅 強 的人能把世界放在手中像泥 塊 一 樣 任意揉捏。 10:55:4810:55:4810:553/24/2023 10:55:48 AM1越是沒有本 領 的就越加自命不凡。 三月 2110:55 上午 三月 2110:55March 24, 20231少年十五二十 時 ，步行 奪 得胡 馬騎 。 三月 2110:55:4810:55Mar2124Mar211世 間 成事，不求其 絕對圓滿 ，留一份不足，可得無限完美。 2023/3/24 10:55:4810:55:4824 March 20231做前，能 夠環(huán)視 四周；做 時 ，你只能或者最好沿著以腳 為 起點的射 線 向前。 10:55:4810:55:4810:55Wednesday, March 24, 20231乍 見 翻疑夢，相悲各 問 年。 polymerase 與 DNA Ligase的異同點？思考題：9. A fragment of mouse DNA with EcoRI sticky ends carries the gene M. This DNA ,which is 8kb long, is inserted into the bacterial plasmid pBR322 at the EcoRI rebinant plasmid is cleaved with two different restriction enzyme. The size fragments that were obtained on an agrose gel are isted below. Draw the restriction map for this sequence. EcoRI BamHI EcoRI + BamHI 思考題：The EndThank You!靜夜四無 鄰 ，荒居舊 業(yè)貧 。（ EcoR I）？、 ExoIII、 DNase I，酶的作用特點。處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結構基因表達亦不相同 5.在同一個 cDNA文庫中，不同類型的 cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉錄而來的。不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結構基因的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的 mRNA所組建的 cDNA文庫也就不同cDNA文庫的特點4.常來自結構基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達的基因的遺傳信息： 1—5%endMechanism5.DNA的連接供體 DNA片段的制備 :pYAC4toweightaBAClargechromosomesYAC:I1） HindIII2）取小片段Hind2)TdT+dGTPEcoRIIICCCC1） HindIII2）取大片段TTTTT CCCCSacIIITTTTTAAAAAmRNAAMVRT+dNTPTTTTTTTTTTAAAAA TdT+dCTPTTTTTAAAAATTTTT CCCCEcoRIHindeukaryoticpromoter:willtoamoleculesPromoter（啟動子） :Expression5） cDNA文庫的形成 — 轉化載體上所加的多聚 C尾巴 反轉錄反應cDNAOkayama–Berg法Synthesis更先進的克隆技術 AdvancedamplificationsolutionConcatemericplatesplaquescoli,suitablepackagedofin vitroConcatemericintocohesive endLigationGATCCTAGvectorSLeft arm Right armS/B S/BGATCCTAGGATCCTAGLigationBIfragments CTAGGATCC CTAGGATCenzyme.CTAGAnnealBamH I Sau3 AGCCTAGGATCCdigestionshearingachievedisshouldlibrary,cloning:ForpreparingDNA.文庫的連接、包裝和擴增Twousedisolationofusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvector vectorCloningDNA5.）4.酶法機械剪切法總 DNA分離純化 phage vector：有效容納量是 15kbcosmid vector：有效容納量是 45kb建立基因組文庫的一般程序：1．載體 DNA片段的制備載體 DNA分離純化 sizesortermedof(DNAforaGenomicCloningforthedeterminegenomeclonesdescribeiscDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigestusingsuitable.CloningvectorswasandofvectorsIfCloningcloneslargetoprocess.efficiencyphage,in vitro mayligaseTargetDNAorofusedenzymeGGGCCCCCCGGGGGGCCCHpaIIHomopolymerGGGCCC5’OHGATCCCCGGG5’GGGCCCGGATCCCCTAGGBamH I+OHGATCCCCGGGofstickyendtheandlinkers,usedoligomersenzyme.DNAforcontainaremoleculesb.a.ofLigationmethods:cDNArebinantsiteselfligation。orphoshpataseofmayorcircularvectorforrequireisendsfragment)ofbluntendsecondstrandGAddGCTTCtransferase+dCTP3’CA3’5’TATT5’T3’5’TCAcDNASynthesisTT3’NaOHOHssTTTAT6RTase HOTAfromtoklenowmRNARNaseRTaseOligo(dT)poly(A)+RNAplementaryfromclassesdifferenteachcellulargenes:cellularcellChapterDNAhost/vectorofDNAPackagingDNATransfectionwithtailingLigationligationUseshearingChoosecellcDNADNAJoiningofallstrategyisinDNADNA體外包裝 TransfectionwithathecohesivelinkerBluntend目的基因克隆沒有任何一種克隆方法能夠涵蓋所有好處，克隆步驟： 1）克隆一個基因的方法： cDNA(anchoring9）種轉錄物，人類的基因約僅有 80tag,expression,簡稱 SAGE)可一次對大量基因轉錄產物進行定量分析，從中找出新的基因。21（ 3）基因表達系列分析法基因表達系列分析法 (serialcDNA克隆。減法雜交的對象可以是 DNA，也可以是 20（ 2）減法雜交技術 提取物，其中一個群體含有一定比例的目的基因 mRNA，另一個群體不含有目的基因 mRNA。6．篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術（ 1）差別雜交法差別雜交（ different