基因表達(dá)調(diào)控及重組dna技術(shù)-wenkub.com
2025-01-05 18:06 本頁(yè)面
【正文】 對(duì)于基因治療，人們擔(dān)心的潛在 危險(xiǎn)之一 是可能會(huì)引起未知的遺傳效應(yīng)，如腫瘤等，此外還涉及社會(huì)倫理方面的爭(zhēng)論。 71 變性： 解開模板雙鏈 DNA 95 ℃ 退火： 使引物與單鏈模板 DNA結(jié)合 55 ℃ 延伸： DNA鏈的合成 72 ℃ 72 2. 克隆載體的選擇與構(gòu)建 目的基因不能自我復(fù)制 3. 目的基因與載體連接（ DNA連接酶 * ） 重組 DNA 4. 重組 DNA導(dǎo)入受體菌 安全菌 感受態(tài) 導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 感染 73 5. 重組體的篩選 （ 1）直接選擇法 抗藥性標(biāo)志選擇 ampr tetr kanr 標(biāo)志補(bǔ)救 α互補(bǔ) 分子雜交 （ 2）非直接選擇法 常用免疫學(xué)方法 特異性強(qiáng)、靈敏度高 74 6. 克隆基因的表達(dá) 常見表達(dá)體系： （ 1）原核 —— 大腸桿菌（簡(jiǎn)單、迅速、經(jīng)濟(jì)） 缺點(diǎn)：無(wú)轉(zhuǎn)錄后加工 —— 適于表達(dá) cDNA 無(wú)翻譯后加工 —— 無(wú)糖基化修飾 包涵體 （ 2）真核 —— 酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)有生物活性的蛋白質(zhì) 75 四、 重組 DNA技術(shù) 的應(yīng)用 1. 疾病基因的發(fā)現(xiàn) 鐮刀形紅細(xì)胞貧血 脆性 X綜合征 (FMRI基因沉默 ) 2. 生物制藥 利用 基因工程 技術(shù)生產(chǎn)有 藥用價(jià)值 的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界上的一項(xiàng) 重大產(chǎn)業(yè) 。 63 Hpa I： 5’ GTT AAC 3’ 3’ CAA TTG 5’ 平端 Pst I： 5’ CTGCA G 3’ 3’ G ACGTC 5’ 3’突出粘性末端 EcoRI： 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’突出粘性末端 64 （四）目的基因 target gene cDNA (plementary DNA) 在體外以 RNA（通常為 mRNA）為模板， 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈 DNA。 58 （二） 重組 DNA技術(shù) * 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（目的基因或目的 DNA）與載體 DNA連接成復(fù)制子，然后通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。 克隆化 （ 動(dòng)詞 ） ： 獲取同一拷貝的過(guò)程 。 50 A B 51 RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子 ? 基本轉(zhuǎn)錄因子 F E B D A RNA pol Ⅱ TATA DNA TATA TFⅡ D TFⅡ A TFⅡ B TFⅡ F TFⅡ E RNA polⅡ 52 ? 轉(zhuǎn)錄激活因子 （正性調(diào)節(jié)因子） 通過(guò) DNA－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用起 正性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。 編碼序列 啟動(dòng)序列 操縱序列 其他調(diào)節(jié)序列 (promoter) (operator) P O (coding sequence) 操縱子 結(jié)構(gòu) 31 乳糖操縱子 調(diào)節(jié)機(jī)制 阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié) CAP的正性調(diào)節(jié) 協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) 32 乳糖操縱子結(jié)構(gòu) CAP結(jié)合位點(diǎn) P I I P O Z Y A 調(diào)控區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 I: 阻遏蛋白編碼基因 PI: 阻遏蛋白基因啟動(dòng)序列 Z: β半乳糖苷酶 Y: 透酶 A: 乙?；D(zhuǎn)移酶 結(jié)構(gòu)基因 O:操縱序列 （阻遏蛋白結(jié)合部位） P:啟動(dòng)序列 CAP結(jié)合位點(diǎn) 調(diào)控區(qū) 33 1. 阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié) （無(wú)乳糖） * 阻遏蛋白與 O序列結(jié)合 , 抑制轉(zhuǎn)錄 , lac操縱子 關(guān)閉 阻遏蛋白 mRNA CAP結(jié)合位點(diǎn) P I I P O Z Y A RNA聚合酶 34 誘導(dǎo)劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與 O序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除， lac操縱子開啟 乳糖 別乳糖
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