遺傳工程ppt課件(2)-wenkub.com
2024-09-18 20:25 本頁面
【正文】 基因槍法是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后又一應(yīng)用較廣的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。 T區(qū)與 Ti質(zhì)粒的 TDNA十分相似，包括① T區(qū)的左右邊界序列 。 克隆特定基因 （ 2） 篩選基因庫 大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列 (DNA， cDNA或寡核苷酸 )作探針 (probe)， 用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針 ， 也可用抗體作探針 ， 篩選基因庫 如：篩選 λ 噬菌體構(gòu)建的庫常利用 菌落雜交法 ： 將經(jīng)重組噬菌體 (來自基因庫 )感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與培養(yǎng)基混合后 ，倒在培養(yǎng)皿中 ， 培養(yǎng)過夜 ， 形成噬菌斑 圖 1211 菌落雜交技術(shù) （ 3） 陽性克隆的分析與鑒定 從基因庫中篩選出的陽性克隆 ， 還需進(jìn)一步分析 、 鑒定 ， 才能得到目的基因 生物信息分析 功能預(yù)測 、 功能鑒定 TDNA標(biāo)簽克隆基因 利用 TDNA插入突變 創(chuàng)造突變體 ， 獲取目 標(biāo)基因或克隆 TDNA 載體構(gòu)建 轉(zhuǎn)化植物（ T1， TDNA雜合子 )收獲 T2種子 篩選 T2，獲突變子，應(yīng)為 3:1分離 確定 TDNA與突變型共分離的個(gè)體 產(chǎn)生純合后代 克隆 TDNA兩側(cè)的植物 DNA 利用側(cè)翼 DNA序列作探針從 cDNA文庫中釣取基因 基因功能的驗(yàn)證（遺傳互補(bǔ)測驗(yàn)，分離的 野生基因轉(zhuǎn)化突變體，回復(fù)功能） 圖 1212 TDNA標(biāo)簽克隆基因的基本原理 基于 PCR的基因克隆 PCR可在數(shù)小時(shí)內(nèi)使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬個(gè)拷貝，可代替一些經(jīng)載體克隆基因的方法。 利用 DNA重組技術(shù)，可從一個(gè)含有 10萬個(gè)基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個(gè)目的基因。 → Vir區(qū)的毒性基因是 TDNA轉(zhuǎn)移所必需的 ， 毒性基因可以順式及反式兩種方式控制 TDNA轉(zhuǎn)移 。a b回紋序列 圖 121通過用相同的限制性內(nèi)切酶切割 形成一個(gè)重組 DNA分子 限制性內(nèi)切酶 SmaI的識別及酶切位點(diǎn) C C C G G GG G G C C C 5C C C G G GG G G C C C,3,3,5,5,5平齊末端 DNA連接酶 DNA連接酶 是重組 DNA分子構(gòu)建必不可少的工具酶，能催化 DNA中相鄰的 3’ –OH和 5’ – 磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段 DNA連接起來 反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄酶 是一類以 RNA為模板來指導(dǎo) DNA合成的 DNA聚合酶，故又稱依賴于 RNA的DNA聚合酶 通常用反轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建 cDNA文庫（ cDNA library） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) PCR是體外快速擴(kuò)增 DNA的方法 ,由美國的Mullis(1986)發(fā)
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