【正文】 形態(tài)檢測：是最先采用的體細胞無性系變異檢測方法。 植物體細胞無性系變異與育種1體細胞無性系變異具有重要的理論和實踐意義n 植物體細胞無性系變異是指植物細胞經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的遺傳變異。 (4)通過育種家與生物技術(shù)工作者的密切配合,以育種家新選育的強優(yōu)勢組合為研究材料,就可以在育種家進行新組合產(chǎn)量與適應性試驗的同時,以分子標記輔助改良恢復系,配置增產(chǎn)潛力更高的新組合。 (2)QTL研究結(jié)果顯示,互作基因的共同作用對水稻產(chǎn)量的遺傳控制也起著重要的作用,部分QTL的表達可能在一定程度上受到遺傳背景的制約。 ②選擇聚集了雙親絕大多數(shù)的有利等位基因的純系。(2)雜交后，自交產(chǎn)生Ｆ2群體,進行QTL定位和分析,明確各QTL的效應及其作用方式。(7)入選品系參加產(chǎn)量試驗和生產(chǎn)性試驗。(3)鑒定各高產(chǎn)品種所具有的有利QTL及其連鎖的分子標記。其理論根據(jù)是：控制水稻產(chǎn)量性狀的基因廣泛地分布于水稻基因組的各個區(qū)域,而不同水稻材料在不同基因座位上表現(xiàn)出有利的效應。? 但是,在優(yōu)良半矮生常規(guī)稻品種和雜交稻組合得到普遍應用后,水稻品種的產(chǎn)量潛力處于停滯不前的狀態(tài)。 (5)以單一性狀為基礎(chǔ),QTL檢測尚在一定程度上受到遺傳背景和環(huán)境條件的影響。 兩者均對水稻產(chǎn)量性狀的遺傳控制起著重要的作用。 在同一座位上,不同等位基因之間的互作也可能不同。2. 控制水稻產(chǎn)量性狀的QTL具有如下基本特點:(1)產(chǎn)量性狀QTL數(shù)量多、分布廣。產(chǎn)生分離群體(Ｆ2及其衍生群體、回交群體、雙單倍體群體或重組自交系群體等)。（5）品種審定及推廣。 五是生長情況。 如單株成穗數(shù)的多少，穗子的大小、著粒密度、結(jié)實率、鈴的大小、成鈴率等。株型的好壞與豐產(chǎn)性密切相關(guān)，因為它直接影響群體的受光狀況．株間的通透性?？疾斓捻椖浚? 一是生育期。 如果仍保持受體的特征特性，則應淘汰， （2）怎樣進行田間選擇? 全部育種材料都必須經(jīng)過田間種植，根據(jù)多代種植的表現(xiàn)，來確定其優(yōu)劣，然后汰劣選優(yōu)。 若D3代穩(wěn)定，各項性狀整齊一致，表現(xiàn)優(yōu)異，則可進入鑒定圃。 同時，要種植受體親本作對照，有條件時，也應種植供體親本。 二是在導入的材料較多時，則可按組合分單株(單穗、單鈴)種植，因為有時在Dl代即表現(xiàn)變異，可以提早進行選擇．按單株收獲。 需要注意的是：有的材料分離世代也很長，有的甚至達6—7代才穩(wěn)定。不過還是稱D1較為合理． （2）導入后代變異的特點 總的來說是分離世代短，穩(wěn)定快。 這種表示法以區(qū)別于有性雜交用F和輻射育種用M表示，因而被廣大學者采用。異地鑒定：在當?shù)貤l件不能滿足性狀鑒定需要時，可在適宜的異地 進行鑒定。在經(jīng)常發(fā)生的逆境條件下進行鑒定。如水稻秧苗的抗寒力與束縛水和可溶性含 糖量有關(guān)，含量高的抗寒力強。 第六章 植物分子育種程序與方法 第一節(jié) 作物常規(guī)品種選育的一般程序 采用分子育種技術(shù)直接選育的結(jié)果，是育成常規(guī)品種：即，在變異的類型中，通過多代選擇,(獲得符合育種目標的穩(wěn)定后代，在特征特性上，表現(xiàn)整齊一致.)然后，通過品系比較，區(qū)域試驗，品種審定等程序，最終，生產(chǎn)上推廣應用。在這種情況下，選擇是困難的，但它卻為育種提供了新的種質(zhì)，因而也是有價值的． 四、形態(tài)變異與生理變異 形態(tài)變異是直觀的，容易辨別，而生理變異則要通過生理生化分析才能能知道。但在外源DNA轉(zhuǎn)化后代中，有時形態(tài)特征沒有變異，但某項生理特性卻產(chǎn)生變異。 在轉(zhuǎn)化后代中，正向與負向變異是同時存在的。 （4）在粒形、碾米品質(zhì)以及蛋白質(zhì)含量等也表現(xiàn)出明顯差異． 方差分析結(jié)果，19個株系中，精米長，精米寬，糙米粗蛋白質(zhì)含量，與受體盧紅早1號相應指標的差異達到了顯著或極顯著水平。（2）堊白度是堊白粒率與堊白面積的乘積，是稻米外觀品質(zhì)的極其重要的指標。結(jié)果： （1）各項品質(zhì)性狀的變異系數(shù)大小依次為堊白度直鏈淀粉含量膠稠度米膠長糊化溫度級別蛋白質(zhì)含量整精米率精米寬精米長精米率糙米率。陳善葆等(1993) 對直接導入外源DNA轉(zhuǎn)移水稻白葉枯病抗性進行了研究． 結(jié)果在供體早生愛國3號DNA導入856403的組合中，有1株抗白葉病特別突出，抗性級別為2級(受體7級以上)，病斑占葉面積5％，如供體高抗白葉枯病。 第五節(jié) 轉(zhuǎn)化后代抗性的變異 黃興奇等(1993) 采用孕穗期莖拄射法導入外源DNA，D2代苗期接種葉瘟病菌鑒定篩選，初選株成株期接種穗頸稻瘟病菌，經(jīng)兩次按種鑒定篩選出的單株，次年再進行苗期接種復篩。 當以早熟品種為受體時，出現(xiàn)超早熟類型的變異較少，而出現(xiàn)稍遲的類型較多。 表現(xiàn)出變異的多樣性。 最明顯的是產(chǎn)生許多大穗類型，每穗著粒效達300粒以上。正反交試驗表明，P1代均表現(xiàn)為匍匐，說明甸匐對直立為顯性。 莖蘗的生長習性主要是指直立生長與匍匐生長兩類。 四類是特殊優(yōu)良的葉形變異。 (3)葉片的變異 一般來說，葉片的變異可以分為四類． 一類是變得長大。 一、水稻 (1)色素的變異 有的與供體基本相似，有的則部分表達。 第四個特點是變異的意外性。 第二個特點是變異的廣泛性。目前采用的DNA供體從動物到植物都有。 目前采用的導入方法很多，花粉管通道法、穗莖注射法，浸漬法等等．由于導入方法的不同，受體整合外源DNA的量相差很大，導致變異頻率的差別。 如季慧強等(1993)以玉米DNA導入二棱大麥，在D1的16株中有2株變異，％，還有8株是潛在變異株，在D2才出現(xiàn)變異，這部分的變異占總處理數(shù)的50％，因此總變異率是62．5％。四是其他原因。 象水稻、小麥等自花授粉的植物，外源DNA導入后代與受體親本間出現(xiàn)的RAPD多態(tài)性，即說明了DNA的變異，而這一變異之來源必定是外源DNA的轉(zhuǎn)化。（2）采用RAPD來揭示后代的遺傳變異現(xiàn)象 在分子育種中常碰到的問題是要轉(zhuǎn)移的供體性狀并沒有合適的分子標記。 RFLP檢測法二、因此，植物轉(zhuǎn)基因工程的策略要轉(zhuǎn)向利用全植物源的基因，在不進行抗生素篩選的前提下對導入進行PCR 、 Southern 檢測。目前常用的報告基因有三類： 一類是抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性的Npt Ⅱ基因，潮霉素抗性的Hpt基因；氯酶素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Cat）另一類是組織顯色的基因，如使葡糖苷酸低物顯色的β葡萄糖苷酶的基因（Gus）；第三類報告基因則是螢光素酶基因（Luc），來源于螢火蟲或弧菌。 例如：利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，將特定的DNA分子插入其TDNA上，并連上合適的報告基因。所以，轉(zhuǎn)座子作為一種新的轉(zhuǎn)移外源基因的載體系統(tǒng)和方法，還需要有更多的實驗來證實和完善。 三、電泳轉(zhuǎn)化法 電泳轉(zhuǎn)化法的基本原理是借在一定電場強度下由負極向正極泳動的DNA泳動力，將DNA引入到靠正極端的受體組織細胞中． 細胞壁是以纖維絲為基質(zhì)而組成的，含有許多小孔，在電場中DNA遷移可通過細胞壁的小孔，并可通過質(zhì)膜而進入細胞． 四、轉(zhuǎn)座子介導法 轉(zhuǎn)座子：是指在細胞中能從同一條染色體的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點或從一條染色體上轉(zhuǎn)移到另一條染色體上的一段特殊的DNA序列； 它通常包含著二種因子：一是自主因子，具有使自身剪切或轉(zhuǎn)座的能力；另一是非自主因子，只有在同一組自主因子存在時才能剪切或轉(zhuǎn)座。二、病毒介導法 病毒侵染植物后，其核酸分子可以進入植物細胞中進行自我復制和蛋白質(zhì)合成。 將它加入到含有受體細胞和外源DNA的轉(zhuǎn)化液中混合振蕩，在相互碰撞中，纖維絲可對細胞產(chǎn)生穿刺作用，那些粘附于纖維絲上或細胞壁上的DNA將隨之進入細胞，而完成轉(zhuǎn)化作用． 值得注意的是，碳化硅纖維吸入肺部容易引起傷害，因此應在通風柜中進行操作，一般先配成5%的懸液備用，以減少它往空氣中的飄逸。 其優(yōu)點是無宿主限制，可適用于各種功能植物材料和各種類型的受體細胞，并且操作簡單、方便，轉(zhuǎn)化效率較高，每分鐘可操作100個左右的細胞，比顯微注射法效率提高20倍，比化學法提高三個數(shù)量級； 另外，還可進行細胞器的基因轉(zhuǎn)化，由于激光微束小于細胞器，它可以在顯微水平上直接對細胞器擊孔，實現(xiàn)外源DNA對細胞器的轉(zhuǎn)移． 但其需要昂貴的儀器設(shè)備，轉(zhuǎn)化頻率只有102～104。一、基本原理激光是一種很強的相干單色電磁射線，細胞膜系統(tǒng)或細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)由于能夠吸收特定波長的激光產(chǎn)生熱效應而引起某種程度的損傷。 這些因素將使得外源DNA進入到細胞中。一、基本原理超聲波是指頻率為210 4～2109Hz的聲波，它的生物學效應主要是機械作用，熱化作用和空化作用。 另外，這種方法無宿主的限制，對胚性愈傷組織、懸浮細胞，分生組織均可采用。隨著E的不斷增大，V也不斷升高，于是膜被壓縮變薄。此法是80年代初發(fā)展起來的，最初主要用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。二、操作步驟 三、基本特點 顯微注射法的突出優(yōu)點是轉(zhuǎn)化率高，有研究表明，它的瞬時表達頻率可達30％或更高，這是其他方法所不及的． 另外，它是一種純粹的物理方法，能適用于各種植物和各種材料。一、基本原理 其基本原理是利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體細胞，并使其成活、增殖而發(fā)育成為轉(zhuǎn)基因個體。 且此方法不受植物種屬的限制，在具備有性生殖過程的任何植物上都能應用． 另外，此法簡便，易于掌握，可以在大田，盆栽或溫室中進行，育種時間短，篩選遺傳穩(wěn)定的品系一般只需3—4代時間， 再者，通過外源總DNA片段的導入可以了解一些具有重大經(jīng)濟價值的農(nóng)藝性狀是否能夠通過DNA片段進行轉(zhuǎn)移、這些性狀是單基因性狀還是多基因性狀，從而能為目的基因的克隆提供參考和材料。因為：（1）精、卵細胞類似天然的原生質(zhì)體；（2）在精子入卵時，卵膜有一個開閉的過程；（3）合子期，胞壁的形成也尚未完備，胞壁的屏障作用還很小，因此外源基因進入受體卵細胞及合子的阻力也較?。海?）雄配子體花粉萌發(fā)時，頂部也擁有無壁的小孔，外源遺傳物質(zhì)也容易吸入．二、操作方法利用花粉管道道導入外源DNA的技術(shù)已發(fā)展出多種行之有效的操作方法，基本歸納為三類：：當受體植物自花授粉一定時間后(一般2~3h）切去花柱； 然后馬上在切口上滴入供體DNA溶液，濃度為50~100ug/ml，溶于1XSSC(150m molNaCl，15m mol檸檬酸鈉，）；最后套袋隔離至種子成熟。第五節(jié) 花粉管通道法花粉管通道法：是利用植物受精過程中形成的花粉管通道將外源DNA導入植物的技術(shù)。二、基本方法 浸漬法，就是將不同的受體系統(tǒng)直接放入供體DNA(包括總DNA和質(zhì)粒DNA)溶液中浸泡一段時間，再經(jīng)過自然發(fā)育或人工培養(yǎng)面得到轉(zhuǎn)化植株。第四節(jié) 浸漬法 浸漬法：是指將植物的種子，胚、胚珠，子房、花粉粒、幼穗，懸浮細胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w細胞并得到整合與表達的一種轉(zhuǎn)化方法。 它可以使細胞膜之間或使DNA與細胞膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連，并可通過改變細胞膜表面的電荷，引起細胞膜透性變化，從而促進外源大分子進入原生質(zhì)體，因此稱之為PEG誘導法。Klein等(1987)首次在洋蔥上對細胞進行試驗，將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chloramphericol acetyl transferase，Cat)基因?qū)胙笫[表皮細胞．1990年美國杜邦公司推出了PDSTDNA轉(zhuǎn)移的過程可簡要地概括如下： ①損傷的植物細胞產(chǎn)生乙酰丁香酮等植物酚類物質(zhì)作為農(nóng)桿菌的侵染信號； ②這些化學誘導物(又稱信號分子)透過農(nóng)桿菌的細胞膜激活VirA和VirG基因，再激活Vir區(qū)的其他基因；③這些Vir基因活化后，其產(chǎn)物對TDNA進行加工、剪切，并引導TDNA整合進植物基因組， ④TDNA在植物細胞中表達產(chǎn)生植物激素，刺激植物形成腫瘤。 載體介導法（間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)）:是將目的DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌或病毒中，并以之為載體，隨著它們對植物的感染面將目的DNA導入植物細胞中。它是分子育種的一個重要技術(shù)環(huán)節(jié)。 二、DNA純度分析蛋白質(zhì)和苯酚在280nm有吸收峰，會使受污染的DNA紫外吸收值OD260／OD280明顯下降。進行電泳比較法DNA定量，要制備標準濃度的DNA。進行紫外吸收光譜法檢測核酸要獲較準確的濃度：一要避免核酸分子的相互污染。苯酚的紫外吸收也在這一峰值。利用這一特性對DNA和RNA的濃度與純度進行檢測。HCI緩沖液，pH ；6~l0mg蛋白酶，37℃繼續(xù)保溫15min；，使終濃度為1~2mol，37℃繼續(xù)保溫30min后，加SDS使終濃度為l％~2％，37℃繼續(xù)保慍15min，4000r／min離心15min；，加乙醇沉淀桉酸，沉淀或細絲溶于5ml 2molNaCl，再加乙醇沉淀核酸，重復2次，最后溶子3ml 2molNaCl；／min離心15min；，2molNaCl洗脫獲純化DNA液。不管采用哪種方法，應該考慮到以下幾點：第一，如果需鑒定的材料數(shù)量有限，就應采取DNA微量提取方案；第二，如果材料含有較多的類萜、丹寧、多糖等，就應在DNA提取中考慮是否能控制住這些物質(zhì)對限制性內(nèi)切酶或PCR聚合酶的抑制作用；第三，如果采用PCR分析，DNA提取步驟越少越好，這是因為PCR反應極其靈敏，多步驟及多種試劑容易引起交叉污染，從而影響PCR分析的準確性?？侱NA導入的后代出現(xiàn)大量變異。 實驗結(jié)果表明后代變異涉及到成熟期，種皮色澤和蛋白質(zhì)含量等方面。另一優(yōu)良品系的來源是以水稻鄂宜105為受體，密穗高梁DNA為供體，采用花粉管通道法進行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)過多代嚴格篩選和檢測，選出了矮稈、優(yōu)質(zhì)、抗病，抗逆性強的水稻新品系DH3和高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的水稻新品系DH5。每667m2產(chǎn)量可達325kg，比供體提高30%．此品系集天然色素，高蛋白、高產(chǎn)于一體，為黑色保健食