【正文】 我的畢業(yè)論文離不開老師、親人及朋友在這四年來對我的付出和關照，我再次向他們表示最誠摯的感謝和最崇高的敬意。武老師的寶貴指導是本論文得以完成的基礎。首先，我要感謝我的論文導師武永軍副教授。在學習上，對專業(yè)知識有了更深的了解。參考文獻[1]Boyer,J. S..Plant productivity and environment[J].Science,1982,218(4571):443448.[2][D].海南,海南大學,2010.[3]張建樹,于學文,[M].北京:科學出版社,2006:123[4][5][M].陳月琴,:科學出版社,2010:196241.[6]楊榮武,鄭偉娟,[M].南京:南京大學出版社,2007:313346.[7]Jan Barciszewski,Volker A. [M].:科學出版社,2008:104120.[8]尤永龍,林丹軍,[M].北京:科學出版社,2011:149178[9]楊晶,胡剛,[M].北京:科學出版社,2010:213231.[10]趙可夫,李法曾,[M],北京：科學出版社,2013:1123.[11]劉友,[M].北京:科學出版社,1998:752769.[12]賈庚祥,[J].④由圖23233可知在相同處理時間不同處理濃度下，看不出miR168表達量的變化規(guī)律。根據(jù)柱形圖趨勢分析，5%、6h處理時的miR097表達量數(shù)據(jù)可能不準確，需要重新進行驗證。而隨著時間的推移，植物受脅迫危害越來越重，miR003的表達自然隨之上升。20%、3h處理時miR003顯著上調表達（—ΔΔCt=），20%、6h處理時miR003也上調表達，但上調幅度相對較?。āうt=）。mirNaCl041驗證為假的RNA。對于通常長度只有20nt左右的miRNA 來說，傳統(tǒng)的定量PCR 技術只能用來測定miRNA 前體的片段。通常的Northern Blot探針有兩種標記方法：（1）地高辛（Digoxin，DIG）標記法；（2）同位素標記法。因為將總RNA溶于DEPC水，所以低離子濃度下A260/，表明純度較高。1 2 3 4 5 6 7圖21 SDS法提取的總RNA電泳圖(1號泳道為CK，2號泳道為5%NaCl、3h處理，3號泳道為10%NaCl、3h處理，4號泳道為20%NaCl、3h處理，5號泳道為5%NaCl、6h處理，6號泳道為10%NaCl、6h處理，7號為20%NaCl、6h處理)，由圖可知提取結果不理想未達到realtime PCR的要求。不同組織的不同處理的RNA的表達有較大差異，反轉錄的 RNA量相同不能說明表達水平是相同的。具體序列參考下表。本研究主要針對與脅迫相關的新預測出的5個miRNAs作了分析，由于實驗選擇進行Real Time PCR驗證miRNA的試劑盒為One Step PrimeScript174。 Real Time PCR 反應①在冰上按下列組份配制PCR反應液。(2)Poly(A) 加尾反應和反轉錄反應①按下列組份配制反應液。⑦4℃，13,500rpm離心15min，棄上清。③用50μl RNaseFree ddH2O定容到100μl后加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25：24:1)混勻。 MiRNA的cDNA的合成提取總RNA后用One Step PrimeScript174。（不要晾的過干，RNA完全干燥后會很難溶解，大約晾干23 min左右即可），根據(jù)實驗需要，加入30ml RNaseFree ddH2O，反復吹打、混勻，充分溶解RNA，70℃保存。 ml 75%乙醇（用RNaseFree ddH2O配制）洗滌沉淀。樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約500 微升）轉移到新管中。棄乙醇并在超凈臺上晾干，加入30mlDEPC水，完全溶解沉淀，70℃保存。：（7：3）的混合液洗沉淀。，加入等體積的氯仿，反復倒置混勻5min。 SDS法提取總RNA(50mmol/L Tris ，150mmol/L LiCl，5mmol/L EDTA，5%的SDS)?！鏃l件下，12000rcf離心10min，并取上清置于新離心管中。（25：24：1），輕柔顛倒混勻，冰上放置10min。，塑料制品等于DEPC水中浸泡1夜后高壓滅菌。本實驗選取生長狀況良好、相似的玉米幼苗，每個處理三株幼苗，每株幼苗取較大兩片葉子邊緣3cm作為材料。NaCl 溶液濃度小于50mmol待種子萌發(fā)后根部大約12cm長時將種子疏松擺放在雙層濕潤紗布上，注意保證紗布水分充足。成分如下表：全營養(yǎng)液中的大量元素：成分分子量使用濃度(mg/L)全營養(yǎng)液中的大量元素：硝酸鉀 KNO3101505硝酸銨 (NH4)2NO38080硝酸鈣 Ca(NO3)22361180磷酸二氫鉀 KH2PO3136136硫酸鎂 MgSO4*7H2O246492全營養(yǎng)液中的微量元素：成分分子量使用濃度(mg/L)微量元素碘化鉀 KI硼酸 H3BO3硫酸錳 MnSO4*4H2O硫酸鋅 ZnSO4*7H2O鉬酸鈉 Na2MoO4*2H2O硫酸銅 CuSO4*5H2O氯化鈷 CoCl2*6H2O鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA硫酸亞鐵 FeSO4*7H2O選取籽粒飽滿、大小均一的玉米種子用3%的H2O2浸泡15min，用蒸餾水將玉米及其殘留沖洗干凈。正常的自然條件下，植物在生長過程中不可避免地會出現(xiàn)很多生物與非生物因素的脅迫作用，鹽脅迫是影響植物生長主要非生物脅迫之一，本實驗試圖從miRNA角度進一步探索玉米受到鹽脅迫時的作用機理。相對論排除了絕對空間和時間的牛頓幻覺、量子力學排除了對可控測量過程的牛頓迷夢、。它涉及生物學、數(shù)學、計算機科學和工程學等學科，是當今生命科學和自然科學的重大前沿領域之一。 microRNA種類間存在協(xié)同作用關系多數(shù)情況下，MicroRNA并不是單一地發(fā)揮作用，往往需要多種microRNA與其它調控因子共同作用。Lu等從受到機械脅迫的毛果楊木質部組織樣品中鑒別出5種與機械損傷相關的miRNA，如受張力和壓力下調表達的 miR15miR162 和miR164；受張力和壓力上調表達的miR408 ；受壓力增強表達的miR15受壓力下調表達的miR160和miR172以及受張力小幅下調表達的miR168。利用miRNA與靶基因結合序列互補的特點，預測了41個有不同功能的靶基因。實驗結果表明，氧化脅迫并不能誘導 CSD1 和 CSD2 基因產物轉錄水平的增加，這兩個CSD 基因的正調控取決于miRNA398 水平。在缺乏磷酸鹽的情況下，miRNA399 表達上調，過量表達 miRNA399抑制其靶基因泛素結合酶 E2的積累從而增加了對磷酸鹽的吸收，miRNA399 可維持植物體內的磷素平衡。Let一7作為腫瘤抑制因子通過靶向其特異基因參與卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺腫瘤等腫瘤進程。2010年，Medina等證明，miR21是一個真正的致癌基因，腫瘤能夠對該致癌microRNA上癮。“致癌基因成癮性”指的是在腫瘤形成過程中雖然包含很多個步驟，但是只要靶向特定的單個致癌基因就能起到治療效果。植物中含有相對更大更復雜的小RNA群體，其中miRNA并不占多數(shù)。大體來講就是，若得到了小RNA的cDNA序列，并且是保守的，則可直接判斷它是miRNA。僅憑二級結構也不能說明它是microRNA，受控于Dicer 酶的物質有許多。能說明其有表達的證據(jù)是：1. 可以采用Northern blotting或者Realtime PCR的方法讓特定的22nt的轉物錄和一個有梯度的RNA樣品雜交。從生物學功能上不能準確區(qū)分二者，因為二者都與RISC結合、對基因進行負調控。 鑒定miRNA的方法無論是構建cDNA 文庫還是高通量測序，在尋找新的miRNA 時，僅靠大小遠不足確定它是 miRNA。(2)miRNA常為2025nt，5’端有U偏愛性并且有獨特的序列特征。植物primiRNA 多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，在植物根、莖、葉、花、果實等器官的生長分化中 都有miRNA的參與。這些小分子RNA在2003年被統(tǒng)一命名為microRNA（miRNA）。lin7是一個21nt 的小分子RNA，作用機制和lin4非常相似，可與lin4相互作用調控線蟲的發(fā)育。其中對miRNA的深入研究，揭示出一種新的基因表達調控方式。溶解曲線：溶解曲線是用于檢測PCR 擴增的特異性和重復性的曲線。在PCR 反應處于指數(shù)期的某一點時，就可區(qū)別出并檢測到產物積累的熒光強弱, 這稱為基線，是產物熒光信號能被檢測到的下限。當游離時, 莖環(huán)結構的分子靶標兩端的熒光基團緊密相鄰, 發(fā)出的熒光被淬滅基團所促滅, 在變性后的復性階段, 探針環(huán)上的核苷酸與靶序列結合, 破壞了莖環(huán)結構, 解除了淬滅作用, 熒光報告基團發(fā)出熒光。所以, 該方法的靈敏度更高，但是成本非常昂貴。因此,給實時定量PCR反應體系中加入SYBR G reen 時,雙鏈DNA上就會因為嵌入SYBR Creen 染料而產生熒光, 通過熒光實時定量PCR 儀來檢測熒光信號的強弱即可分析被合成核酸的量。常用實時定量PCR的檢測有熒光染料嵌入法和探針法。故，通過體外控制溫度的高低交換, 可操控DNA 的變性和復性。在鹽水灌溉條件下, 加入硅可使小麥產量降幅從46 %減少到4 %。 鈰（Ce）對受鹽脅迫玉米的作用鈰是一種稀土，可用于酸雨、重金屬、臭氧及農藥污染防治等方面，而且對鹽脅迫的玉米也有一定作用。但在實際上ABA 處理后, 捕獲的光能下降、熱耗散增加，有效地緩解了鹽脅迫下玉米受光能傷害的程度。AM真菌提高玉米耐鹽性的另一機理是其可使受鹽脅迫的玉米CAT活性升高、H2O2 含量下降從而保護玉米細胞膜的完整程度。在NaCl 脅迫下無論是否接種AM真菌，玉米植株生物量都減少, 而不接種AM 真菌的玉米的減少幅度比接種AM的真菌高10% 。SNP（硝普鈉）是一種NO供體，用50mmol/L以上濃度的SNP保護受鹽脅迫的玉米，可以增加玉米幼苗的干物質積累速率。+從而減少到達地上部的Na+。NaCl脅迫處理的玉米苗鮮重和干重都會減少，尤其是處理時間較長時。鹽脅迫抑制生長的原因有很多，一是由于鹽分破壞膜透性和離子平衡而對植物產生傷害，二是鹽分脅迫影響了葉綠素含量及導致氣孔關閉等抑制光合作用。大部分非鹽生植物都是Na+敏感植物，鹽分對非鹽生植物的最普遍的影響就是生長抑制。隨著污染加劇，由于灌溉不當和大量施用化肥等原因,次生鹽堿化土壤面積還在繼續(xù)擴大,給農業(yè)生產造成重大損失。利用realtime PCR的數(shù)據(jù)做出相對表達量的柱狀圖并分析，做出推斷。鹽漬化土壤在我國分布廣、面積大，已成為一種嚴重的環(huán)境問題和制約糧食生產的主要因素之一。NaCl脅迫下玉米幼苗葉片中幾個microRNA的real—time PCR 鑒定上的畢業(yè)論文目錄目錄 1摘 要 4關鍵詞 4ABSTRACT 5KEY WORDS 5 6 6 鹽害簡介 6 鹽害