【正文】 PCR用于植物病毒的鑒定與分類，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便，特別當(dāng)樣品病毒含量低，血清學(xué)方法難以檢出時(shí)，效果更好。 dsRNA分析法的局限性 （ 1）無法用于大數(shù)量樣本的檢測(cè)； （ 2）檢測(cè)需要知識(shí)和技能，尤其當(dāng)無法與已知病毒相比較時(shí)； （ 3）病毒檢測(cè)時(shí)進(jìn)行的 dsRNA分析，常包括潛隱病毒和非病毒的 dsRNA； （ 4） dsRNA不能用于 DNA病毒檢測(cè)。 已用于一些病毒屬的分類研究 (如黃化病毒屬、馬鈴薯Ｙ病毒屬、番石竹潛病毒屬、煙草壞死病毒屬、黃瓜花葉病毒屬、絨毛煙斑駁病毒屬 ) 。但不利常規(guī)檢測(cè) ,且探針壽命短。 待測(cè)核酸 —— 克隆的基因片段、未克隆化的基因組 DNA、病毒總 RNA。 病毒檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù) 靈敏度高、特異性強(qiáng) 、 檢測(cè)速度更快 、 操作簡(jiǎn)便 、 可用于大量樣品的檢測(cè)。 將點(diǎn)好樣的膜置于盛有 2％脫脂奶粉的 PBS封閉液的培養(yǎng)皿中，封閉液的用量以覆蓋膜為宜．在 37℃ 下溫浴 lh或 4 ℃ 過夜 用 PBSTbuffer洗膜 3次， 5min/次 將清洗后的膜轉(zhuǎn)入含有特異性抗體的封閉液或 PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中， 37℃ 下溫育 3h或 4℃ 過夜 7 洗畢，將膜轉(zhuǎn)入含堿式磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔第二抗體的 PBS緩沖液中， 37℃ 下溫育 3h或 4℃ 過夜 9 將 NC膜 轉(zhuǎn)入顯色液中直至陽性對(duì)照顯色為止（ 5~10min） 10 待陽性對(duì)照顯示清晰的紫藍(lán)色時(shí)，將膜轉(zhuǎn)入蒸餾水中．終止反應(yīng) 終止反應(yīng)后．將膜放置于干凈的衛(wèi)生紙之間，使之干燥，待完全干燥后過塑，便永久保存和觀察 植物病毒的檢測(cè) —— 組織印跡法的靈敏度 ? 一次切割，連印 45次（蕙蘭花葉病毒） ? 感病葉汁液稀釋 1： 100 000，均呈 + ? 靈敏度可達(dá) 20pg/ml (1pg=1 1012g) ? 較 ELISA方法靈敏 2～ 3個(gè)反應(yīng)級(jí) 免疫學(xué)方法受到的限制 ① 檢測(cè)病毒的基礎(chǔ)是利用 病毒外殼蛋白的抗原性 ,但有些植物病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白 ,而類病毒則沒有外殼蛋白 。 植物病毒的檢測(cè) —— 組織印跡法 基本原理 與間接 ELISA相同，首先將待測(cè)樣品印跡在固相載體 —— NC上，用病毒的家兔特異性抗體 (Ig)與吸附在固相載體上的病毒進(jìn)行特異性反應(yīng)，再與堿式磷酸酶(Alkaline phosphatase AP)標(biāo)記的第二抗體（羊抗兔Fc）進(jìn)行反應(yīng)，最后用堿式磷酸酶的反應(yīng)底物BCIP/NBT(5bromo4chloro3indolyl phosphate/ nitro blue tetrazolium)進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的變化，確定病毒的感染程度。 抗原 /抗體 吸附在 NC膜上，通過與相應(yīng)的 抗體 /抗原 和酶標(biāo)記物反應(yīng)形成酶標(biāo)記的 抗原 抗體復(fù)合物 ，加入相應(yīng)底物后顯色，呈現(xiàn)肉眼可見的顏色斑點(diǎn)，根據(jù)顏色有無和深淺判定。 免疫學(xué)方法 在病毒檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的有： 2. 免疫擴(kuò)散 （單向與雙向） – 用于比較同源、異源抗原，可區(qū)別病毒不同種和不同株系。 1973年發(fā)明以來，已成為植物病毒研究的一個(gè)重要手段，尤其是 膠體金免疫電鏡技術(shù) 。在電鏡觀察中，使抗原更為突出，易于觀察。 (磷鎢酸及其鉀或鈉鹽作負(fù)染劑） – 免疫吸附電鏡技術(shù)（ ISEM） ： 電鏡與血清學(xué)技術(shù)結(jié)合：如膠體金免疫電鏡技術(shù)成功用于檢測(cè)病汁液中不同形態(tài)的病毒。 六、植物抗病毒基因工程 局限性與危險(xiǎn)性 應(yīng)用前景矚目，美國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因植物有抗病毒西葫蘆，番茄和番木瓜等，目前國(guó)內(nèi)也有轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草、番茄和甜椒的產(chǎn)品獲準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用。 反義基因是與目的核酸序列 (正鏈或負(fù)鏈 )互補(bǔ)的反義序列，它可以抑制或封閉目的基因的復(fù)制、剪接和表達(dá)。 六 植物抗病毒基因工程 (三 )、 移動(dòng)蛋白介導(dǎo)的保護(hù)作用 (Movement Protein Mediated Protection, MPMP) ? MPMP機(jī)理 ?屬于 蛋白質(zhì)水平 介導(dǎo)的抗性 ?轉(zhuǎn)基因表達(dá)的失去功能的 MP與接種病毒的野生型 MP競(jìng)爭(zhēng)胞間連絲上的結(jié)合位點(diǎn) ?許多不同病毒的 MP可能與相同的胞間連絲成分起作用 (廣譜抗性的例子暗示 ) ?也可能涉及病毒編碼的蛋白、病毒基因組和寄主因子間的 相互作用 六 植物抗病毒基因工程 六 植物抗病毒基因工程 (四 )、 病毒基因相關(guān)的其它序列介導(dǎo)的抗性 ? 核酶 ( Ribozyme， Rz)和反義基因 核酶是一種能特異切割 RNA的 RNA，依據(jù)已知的病毒基因組的特定區(qū)域序列設(shè)計(jì) Rz,使它能特異地識(shí)別、切割病毒的特定區(qū)域，從而切斷病毒基因組，破壞其生物功能。 ? 只有當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物 表達(dá)的是失去功能的 MP時(shí)，才能顯示出抗性。 ?目前傾向于把 CPMP與其它抗性基因策略相結(jié)合。有些限制病毒在細(xì)胞間的 移動(dòng) 或通過維管束系統(tǒng) 長(zhǎng)距離遷移 。 六 植物抗病毒基因工程 (一 )、復(fù)制酶介導(dǎo)的保護(hù)作用 (RPMP) 3)作用范圍相對(duì)較窄 RPMP一般對(duì)提供 RP基因的親本病毒株系有抗性，而對(duì)那些與親本株系顯示一定序列差別的同種不同株病毒不表現(xiàn)抗性。 利用病毒衛(wèi)星 RNA使植物抗病毒 返回 選育抗病品種的一般程序 ? 確定選育對(duì)象 ? 品種抗性測(cè)定（與病毒株系分化結(jié)合） ? 根據(jù)本地品種和分離物的研究收集外地品種和病毒的分離物，比較反應(yīng)差異 ? 引進(jìn)該病毒國(guó)外所用的鑒別品種 （四）、化學(xué)防治 化學(xué)物質(zhì)： 金屬鹽類 :ZnSO4 CaCl2 有機(jī)酸類 :類黃酮、水楊酸、清潔劑（ Tw80、 Triton100） 嘌呤嘧啶類： 三嗪類、 8偶氮鳥嘌呤 維生素類： VB2 ；植物激素類：赤霉素、激動(dòng)素 蛋白質(zhì)類 氨基酸類 : 牛奶、原亮氨基酸 天然物質(zhì)： 多糖類 蛋白質(zhì)類 糖蛋白類 蛋白多糖類 返回 抑制病毒侵染、病毒蛋白的合成 分子量在 10000~55000Da 從微生物代謝產(chǎn)物中提取抗病毒抑制劑 六 植物抗病毒基因工程 ? 復(fù)制酶介導(dǎo)的保護(hù)作用 (Replicase Mediated Protection， RPMP) ? 外殼蛋白介導(dǎo)的保護(hù)作用 (Coat Protein Mediated Protection, CPMP) ? 移動(dòng)蛋白介導(dǎo)的保護(hù)作用 (Movement Protein Mediated Protection, MPMP) ? 病毒基因相關(guān)的其它序列介導(dǎo)的抗性 ? 非病毒來源的基因介導(dǎo)的抗性 P315319 (一 )、復(fù)制酶介導(dǎo)的保護(hù)作用 (Replicase Mediated Protection， RPMP) 復(fù)制酶 (RP)是指由病毒編碼的，能特異合成病毒 + RNA、 RNA的 RNA聚合酶 ，其核心功能是合成全長(zhǎng)的病毒基因組 RNA。可傳 CMV的有 75種，桃蚜能傳 100多種病毒 ? 為害農(nóng)作物，難防治。 在胚內(nèi) within the embryo：真正意義上的種傳 （一）、非介體傳播 種子傳染 seedtransmission 病毒種傳的重要性 （ 1）早期提供 毒源 ，引起病毒病流行 種子帶毒后，直接使幼苗發(fā)病， 為大田侵染提供了初侵染源 （ 2） 遠(yuǎn)程傳播 通過種子進(jìn)出口、種子 調(diào)撥使病區(qū)擴(kuò)大 花粉能傳毒，種子一定能傳毒 （一）、非介體傳播 土壤傳播 soiltransmission 病毒進(jìn)入土壤的途徑： （ 1）病殘?bào)w帶入 （ 2）病株根部滲入土壤 土傳病毒病害的特點(diǎn)： （ 1）病害開始往往局限于小塊發(fā)病中心 （ 2）傳播速度慢 （ 3）土壤傳染性可長(zhǎng)期保持 （ 4）干燥喪失傳染性 線蟲傳，否則真菌傳 （一）、 非介體傳播 菟絲子傳染 Cuscuta 可將復(fù)合感染的病毒分開 嫁接傳染 頂接、側(cè)接、靠接、套接 受接穗和砧木親和力影響 會(huì)將病株中其它病毒也同時(shí)傳播 (二 ) 介體 vectors傳播 蟲毒為害和真正的病毒病害的區(qū)別： 蟲 毒 病毒病害 0 昆蟲分泌的對(duì)植物有毒物質(zhì) 病毒所致 毒素在植物體內(nèi)不能增殖 病毒可在植物體內(nèi)增殖 中毒植物在一定情況下可恢復(fù) 極少能恢復(fù) 受害程度與昆蟲飼食時(shí)間蟲數(shù) 不成正比 產(chǎn)毒能力有遺傳性 只有少數(shù)能通過卵傳 無性繁殖材料或嫁接不傳 可嫁接、無性繁殖材料傳 防治與控制昆蟲效果成正比 常不成比例 主要介體有： 昆蟲、真菌、螨類、線蟲類 昆蟲介體有： 蚜蟲、葉蟬、飛虱、甲蟲、薊馬、