生物樣品的預(yù)處理ppt課件-wenkub.com
2025-04-28 13:36 本頁面
【正文】 ? 2. 超濾 —— 屬加壓膜分離技術(shù)之一 BioPharm ㈣ . 干膠溶漲法 ? 加入具一定孔徑微孔能吸水的凝膠，如葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺 ? 方式：直接加入或在半透膜外吸收 ㈤ . 多聚物吸水法 ? PEG、 PVP、 CMC等具強大吸水力，可在半透膜外吸收。 保護劑（穩(wěn)定性），如對含巰基的酶添加谷胱甘肽等巰基保護劑 BioPharm 用量 ? 目標 收率（ 80%以上）且目的物濃度大 ? 動物、微生物 —加 ～ 3體積的提取劑； ? 植物 —加入 ～ 1體積的提取劑。 考慮因素如下： （ 1） ．離子強度 影響物質(zhì)溶解度的主要因素，適當?shù)牡碗x子強度溶液（ ～ ）除增加溶解度，還對活性有穩(wěn)定作用。 BioPharm 選擇依據(jù) ? 總原則：最大提取、不易變性、減少干擾 – 具體須從材料特性、目的物特性綜合考慮 ? 材料細胞的特性 – 動物細胞易破碎，只需用溫和方法 – 植物細胞較難破碎，須用中等或強度大的方法 – 微生物細胞較復(fù)雜，一般用較強的方法 BioPharm ? 目的物的特性 ⑴．細胞中的位置 ? 游離狀：只需溫和破碎，除去不溶部分。 表面活性劑法 ? 添加如十二烷基磺酸鈉、去氧膽酸鈉等，通過破壞細胞膜而破碎細胞，釋放目的物。 ? 適用：處理胞壁較脆弱的微生物。其對細胞的破碎與空穴的形成有關(guān)。 BioPharm 研磨法與珠磨法 ? 研磨法 (實驗室規(guī)模 ) 由陶瓷的研缽和研桿組成，加入少量研磨劑（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） ? 珠磨法 (工業(yè)規(guī)模 ) 進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英沙、氧化鋁等研磨劑（直徑 1 mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎 ,釋放出內(nèi)含物。 ? 提取： – 目的物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中。 ? 包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達產(chǎn)物。細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。 BioPharm 動物組織預(yù)處理注意事項 ? 勻漿化前的預(yù)處理 (冷凍 ) ? 提取物緩沖液的選擇 (中性 ) ? 蛋白酶抑制劑的添加 ? 保護劑的添加 (β 巰基乙醇、 EDTA、輔酶等 ) ? 提取液的澄清 ( 高速離心、沉淀、吸附等 ) BioPharm 微生物物質(zhì)的提取制備 ? 各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有所不同。 ? 由于不能確定次級代謝產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，目前沒有什么特殊的方法來解決這個問題 BioPharm 多糖的提取 ? 多糖廣泛存在于植物、微生物（細菌和真菌）和海藻中，來源很廣。 BioPharm 蛋白雜質(zhì)的影響及對策 ? 蛋白質(zhì)是污染 RNA樣品的又一個重要因素。 – 酚類化合物與 RNA不可逆結(jié)合 – 導(dǎo)致 RNA活性喪失、用苯酚或氯仿抽提時 RNA丟失、形成不溶性復(fù)合物 – 多糖會形成難溶的膠狀物，與 RNA共沉淀 – 萜類化合物和 RNase會造成 RNA的化學(xué)降解和酶解 BioPharm 酚類化合物的干擾及對策 ? 還原劑法 – 2巰基乙醇 (ME) 、二硫蘇糖醇（ DTT）或 Cys 來防止酚類物質(zhì)被氧化，硼氫化鈉（ NaBH4）是可還原醌的還原劑 ? 螯合劑法 – PVP和 PVPP中的 CO－ N＝基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強 ? Tris硼酸法 – 硼酸可與酚類靠氫鍵形成復(fù)合物，抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合
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