細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件-wenkub.com
2025-01-14 20:59 本頁(yè)面
【正文】 ? 在這基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的移植對(duì)象和要求，或直接定向誘導(dǎo)分化為功能性細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等）；或定向誘導(dǎo)分化為組織干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等），這類組織干細(xì)胞也可直接取材于成體組織或器官，最終植入患者病變部位。 （四）細(xì)胞治療與組織工程 ? 細(xì)胞治療是指用體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞，或者是導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞，或者是利用由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的特定細(xì)胞，植入患者病變部位以代償病變細(xì)胞喪失的功能。這些方法多用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。 ? 基因轉(zhuǎn)移又常稱為基因轉(zhuǎn)染（ gene transfection）。重組卵需經(jīng)一定時(shí)間的體外培養(yǎng)，或放入中間受體動(dòng)物輸卵管內(nèi)孵育，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，有的動(dòng)物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受體子宮里。 1997年誕生的克隆羊 “ 多利 ” 就是體細(xì)胞核移植技術(shù)的產(chǎn)物。1975年 Koehler和 Milstein將用綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞和體外培養(yǎng)能長(zhǎng)期繁殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得了具有兩種親本細(xì)胞特性的雜交細(xì)胞，即既能在培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期生長(zhǎng)增殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細(xì)胞的抗體的 B淋巴細(xì)胞雜交瘤。在實(shí)際工作中常采用各種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺(tái)病毒、化學(xué)融合劑如聚乙二醇（ PEG）及電激融合法等。因此在此對(duì)這些相關(guān)技術(shù)作一簡(jiǎn)介。 細(xì)胞培養(yǎng)的意義 主要在于兩點(diǎn)，其一是人工培養(yǎng)條件易于改變并能嚴(yán)格控制，便于研究各種因素對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命活動(dòng)規(guī)律的影響；其二是細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長(zhǎng)期存活和傳代，可以比較經(jīng)濟(jì)地、大量地提供在同一時(shí)期、條件相同、性狀相似的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣本。 新生 SD大鼠肺成纖維細(xì)胞（原代） 培養(yǎng)的天數(shù)： 48h 放大倍速：倒置顯微鏡 X40 培養(yǎng)基種類： RPMI1640+10%小牛血清 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述 :細(xì)胞呈梭形，有偽足，邊緣清晰整齊，貼壁生長(zhǎng) 胰島細(xì)胞株 RINm5f 培養(yǎng)的天數(shù)： 4d 放大倍速：倒置顯微鏡 10*倍； 養(yǎng)基種類： DMEM+10%胎牛血清 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述 :細(xì)胞貼壁生長(zhǎng) 大黃魚腎細(xì)胞系 PCK： cell line： PCK； passage： 75； microscope： X10media： M199+10%FNS staining: Gimsa 人 bmsc原代細(xì)胞 培養(yǎng)的天數(shù)： 3d 放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 放大 40倍 培養(yǎng)基種類： DMEM+10%胎牛血清；細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述 :少數(shù)細(xì)胞貼壁變形，呈梭形，體積較大，與周圍細(xì)胞間有明顯的透光區(qū)，以后呈克隆樣生長(zhǎng)，低倍鏡下可見(jiàn)梭形鏤空現(xiàn)象 Molt4細(xì)胞 成人 T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株 細(xì)胞的天數(shù)： 2d。 （ 2）病毒污染 ? 傳代細(xì)胞帶有潛伏病毒。固定細(xì)胞以 Hoechst 33258染色，然后置熒光顯微鏡下觀察。實(shí)際上細(xì)胞已受到各方面潛在的影響，如細(xì)胞變性、 DNA合成受影響等。 ? 細(xì)菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)瓶液體初看不混，但稍加震蕩，就有很多混濁物漂起；倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量細(xì)小的圓球狀顆粒飄浮，有時(shí)在細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞生長(zhǎng)停止并有中毒表現(xiàn) 。微生物污染一旦明確，多數(shù)將無(wú)法救治。在液氮中可長(zhǎng)期保存 。 ? 如向培養(yǎng)基中加入 保護(hù)劑 甘油或二甲基亞砜（ DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。研究工作也要求細(xì)胞株的代數(shù)應(yīng)維持在一定期限內(nèi)。 消化傳代的基本過(guò)程是： ? 吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，向瓶?jī)?nèi)加入少量約1～ 2ml消化液（一般含胰蛋白酶、 EDTA），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面； ? 然后在 37℃ 環(huán)境下孵育 13min，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即倒掉消化液，加入 Hanks液沖洗一次以終止消化； ? 然后加入少許培養(yǎng)液，用彎頭吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落形成細(xì)胞懸液，以 1： 2或 1： 3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。 培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。 (2)組織塊的分離方法 ? 培養(yǎng)材料為組織塊時(shí)，首先要把組織塊剪切至盡量小，然后用消化法使組織進(jìn)一步分散，以獲得細(xì)胞懸液。 二氧化碳培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu) 二、技術(shù)方法 ? 1．細(xì)胞分離和原代培養(yǎng) ? 原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，指從供體取得組織，分離得到所需細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶，進(jìn)行首次培養(yǎng)。 水套排水口（在水套注滿過(guò)程中或熱脹冷縮時(shí)讓空氣逸出，不能覆蓋）。 ? 培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu) ? 以水套式 CO2培養(yǎng)箱為例，培養(yǎng)箱基本有三壁結(jié)構(gòu)箱體、控制中心（包括鍵盤、顯示器、指示器等）、CO2/O2傳感器、增濕盤等。 （ 2） 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)環(huán)境： CO2恒溫孵育箱 ? CO2恒溫孵育箱是目前普遍應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備， ? 箱內(nèi)應(yīng)置水槽以維持箱內(nèi)溫度、濕度和避免培養(yǎng)液蒸發(fā)， ? 蒸餾水需無(wú)菌水并應(yīng)加無(wú)腐蝕性和無(wú)揮發(fā)性的防腐劑以防生霉。一般配成 100倍濃縮液，可用 PBS或培養(yǎng)基配制。最常用的是大豆胰酶抑制劑。 ? 添加組分包括： 促貼壁物質(zhì)： 一般是細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白（ FN）、層粘連蛋白（ LN）等。 無(wú)血清培養(yǎng)基 ? 無(wú)血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可維持細(xì)胞在體外生長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。 本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨試一試，許多培養(yǎng)基可以適合于多種細(xì)胞。 HamF HamG12 ? 特點(diǎn)
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