【正文】 （九） 酶分子修飾的應(yīng)用? 酶學? 醫(yī)藥? 工業(yè)抗體酶研究開發(fā)? 核酸類酶人工改造? 有機介質(zhì)酶催化反應(yīng)習題? 1.氨基酸置換修飾? Bender等成功地利用化學修飾法將 枯草桿菌蛋白酶 活性中心的 絲氨酸 轉(zhuǎn)換為 半胱氨酸 。例如：? 酪氨酰 tRNA合成酶 可催化酪氨酸和其所對應(yīng) tRNA，若將該酶第 51位的 蘇氨酸 由脯氨酸 置換，經(jīng)修飾后的酶對 ATP的親和性提高近 100倍，酶活力提高 25倍；? T4溶菌酶分子中第 3位的 異亮氨酸 換成 半胱氨酸 后，該半胱氨酸可與第 97位的半胱氨酸形成 二硫鍵 ，氨基酸置換修飾后的 T4溶菌酶，其活力保持不變，但該酶對 熱的穩(wěn)定性卻大大提高 。? 酶蛋白主鏈修飾主要是靠 酶切 /酶原激活 法。? 主要有：四硝基甲烷 酚羥基修飾反應(yīng)六、咪唑基修飾反應(yīng)七、色氨酸吲哚基修飾反應(yīng)八、 分子內(nèi)交聯(lián)劑 ：? 原理：用含有雙功能團的化合物，與酶分子內(nèi)兩個側(cè)鏈基團反應(yīng)，在分子內(nèi)共價交聯(lián)，可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而也使酶的催化穩(wěn)定性增加。 二羰基化合物可與胍基縮合生成穩(wěn)定的雜環(huán)。羧基修飾反應(yīng)碳二亞胺三、 巰基修飾劑 ：? 原理： 半胱氨酸殘基 側(cè)鏈中含有巰基。– 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亞硝酸、乙亞胺甲酯、 O甲基異脲、 順丁烯二酸酐 等。 ? 經(jīng)常被修飾的殘基是： – 親核的 Ser、 Cys、 Met、 Thr、 Lys、 His– 親電的 Tyr、 Trp常用的化學修飾劑側(cè)鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。在研究酶的 活性中心中的必需基團 時經(jīng)常采用。? 精氨酸酶經(jīng) PEG結(jié)合修飾后，其抗原性顯著降低。使抗體或抗原的特定結(jié)構(gòu)改變，則它們之間不再特異結(jié)合。酶的穩(wěn)定性用半衰期（指酶的活力降低到原來活力一半時所經(jīng)過的時間）表示。水溶性大分子通過共價鍵與酶分子結(jié)合后，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，使酶的活性中心更利于和底物結(jié)合，形成準確催化部位。 例如，聚乙二醇（ PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（ Ficoll）、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。? 大分子結(jié)合修飾是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。? 有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。（ 3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 三、酶分子的修飾方法 ? 金屬離子置換修飾? 大分子結(jié)合修飾 (共價 /非共價 )? 側(cè)鏈基團修飾? 肽鏈有限水解修飾? 氨基酸置換修飾? 核苷酸置換修飾? 酶分子的物理修飾 （一）酶的金屬離子置換修飾? 把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為 金屬離子置換修飾。酶分子修飾的條件? 修飾反應(yīng)盡可能在 酶穩(wěn)定條件 下進行，并盡量 不破壞酶活性功能的必需基團 ，使 修飾率高 ，同時酶的 活力回收高 。酶分子修飾的意義? 提高酶的 活力 activity? 增強酶的 穩(wěn)定性 stability? 降低或消除酶的 抗原性 immunological property? 研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響 structure 二、酶分子修飾的基本要求和條件 ? 對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)的特點，在催化反應(yīng)中受到 穩(wěn)定性、反應(yīng)條件 等制約，早期能大規(guī)模應(yīng)用的酶還不夠多，酶工藝也不完善。是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標。? (加入酶的總活力 上清液中未偶聯(lián)酶活力 )100%4. ? 2.（三）、固定化酶（細胞）的評價指標? 1. 與自然酶基本相同。固定化載體與底物電荷 相反 ，固定化酶的表觀 Km值 降低 。? 向酸性偏移。帶負電荷載體 ? 4.③ 固定化部分阻擋了外界不利因素對酶 的侵襲。? 如：氨基?；福? 天然酶， 70℃ ， 15分鐘，酶失去活性。通常低于天然酶（有例外）。分配效應(yīng)和擴散限制效應(yīng)? 1.常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。4+10% 左右的細菌菌體 (預熱到 42℃ ）再冷卻到 在 5080℃ 加熱 10分鐘，使菌體自溶作用的酶失活，而葡萄糖異構(gòu)酶仍然保持活性，長期使用酶活力不減少。一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。酶的四種固定化方法固定化方法 吸附法 包埋法 共價結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法 離子吸附法制備難易 易 易 較難 難 較難結(jié)合程度 弱 中等 強 強 強活力回收 高，酶易流失高 高 低 中等再生 可能 可能 不能 不能 不能費用 低 低 低 高 中等底物專一性 不變 不變 不變 可變 可變各種酶固定化方法的優(yōu)缺點比較分類方式 固定化細胞 分類方式 固定化細胞細胞類型 微生物植物動物生理狀態(tài) 死細胞 :完整細胞 ,細胞碎片 , 細胞器活細胞 :增殖細胞 ,靜止細胞 , 饑餓細胞（二）細胞的固定化方法 2.? 缺點： 只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。 半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約 25nm。包埋法（ entrapment）? 將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。? ———? 雙功能試劑：? 常用的是戊二醛 （ crosslinking）? 優(yōu)點： 酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。重氮化法 。 ? 常用的偶聯(lián)反應(yīng)有：? ? coupling） ? 2）離子結(jié)合法（ ion? (2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護作用，穩(wěn)定性提高。局限性：? (1)細胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要的副產(chǎn)物。? ? ? (2)酶活性下降。水溶性酶 水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)什么是固定化酶？? 優(yōu)點：? (1)可提高穩(wěn)定性。 (immobilized游離酶的缺點：? ，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）。 非競爭性抑制曲線非競爭性抑制中， Vmax變小，Km不變，即在底物濃度不變情況下，降低了反應(yīng)的最大速率。酶與抑制劑結(jié)合后還可以與底物結(jié)合；酶與底物結(jié)合后還可以與抑制劑結(jié)合。大多數(shù)競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)類似如： 丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。+IEIES P+? 金屬螯合劑： EDTA凡是使酶的必需基團或酶的活性部位中的基團的化學性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，叫酶的 抑制劑 （ inhibitor） Co2+、 Fe2+? 陰離子： pH）。? 反應(yīng)活化能的一般測定方法是測定不同溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)，根據(jù)阿累尼烏斯公式：? 酶的最適溫度不是一個固定不變的常數(shù)?(1).Vmax[E]混合級反應(yīng)單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及 Km推導 原則 ： 從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照? 當?shù)孜餄舛冗_到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達到最大值（ Vmax），此時再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。tgene表達CAP基因 結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位因 分解代謝物阻遏R LacZ LacY LacamRNA mRNAZ mRNAY mRNAa 基 實驗： 細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。結(jié)構(gòu)基因可以表達阻遏蛋白 (無活性 ) 酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合 ,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因 ,結(jié)構(gòu)基