【正文】 內(nèi)源性IL1β在脊髓I/R 損傷時(shí)的表達(dá)進(jìn)行定性和定量的動(dòng)態(tài)觀察,了解它們?cè)贗/R損傷不同階段的變化規(guī)律和病理生理意義。旨在探討脊髓I/R 損傷對(duì)血脊髓屏障損害的分子機(jī)制，為臨床阻遏脊髓繼發(fā)性損害提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar大鼠由白求恩醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 主要化學(xué)試劑和酶 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosy1) SIGMA公司, 美國(guó) 對(duì)硝基酚β纖維二糖苷 (pNPC) SIGMA公司,美國(guó) 焦碳酸二乙酯(DRPC) SIGMA公司,美國(guó) RNasim、Agorose、dNTPs(dATP,dGTP, dCTP, dTTP)華美公司。 異硫氫酸胍 PROMEGA公司,美國(guó) AMV反轉(zhuǎn)錄酶 PROMEGA公司,美國(guó) TaqDNA聚合酶 PROMEGA公司,美國(guó) B巰基乙醇(BME)、Tris SANGON 公司,加拿大 抗大鼠ICAM1單克隆抗體Ig GISEROTEC公司,英國(guó) 免疫組化染色SPTM試劑盒 ZYMED公司,美國(guó) EITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG JACKSON公司,美國(guó) RTPCR試劑盒 PROMEGA公司,美國(guó) HISTOPAQUE1077 SIGMA公司,美國(guó) 磷酸鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物 SIGMA公司,美國(guó) HTAB STGMA公司,美國(guó) M199培養(yǎng)基 GIBCO公司,美國(guó)液體配制PBS緩沖液(1000ml) NaCl 8g KCL Na2HPO4H2O KH24 變性溶液(100ml) 異硫氫酸胍 50g %DEPC水 10%十二烷基肌氨酸鈉 一巰基乙醇 培養(yǎng)液M199 滅活的胎牛血清 20% 谷氨酰胺 2mM Hepes 20mM 肝素鈉 100u/ml 青霉素、鏈霉素 100u/ml ECGS 主要儀器 PEKIN ALMER 2400 PCR擴(kuò)增儀 美國(guó) SIGMA ZK15型 低溫高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó) PHARMACIA DNA/RNA 測(cè)定儀 美國(guó) HITACHI U3400 分光光度計(jì) 日本 Bechman 71PH 計(jì) 美國(guó) 熒光生物顯微鏡 OLYMPUSBAS, 日本 倒置顯微鏡 OLYMPUSCK2, 日本 多普勒血流圖像儀 瑞典 二氧化碳培養(yǎng)箱 TEHER, 日本 低溫高速離心機(jī) 日立SCR20BA, 日本 低溫超速離心機(jī) 日立70P72, 日本 Soniprep 150超聲粉碎儀 英國(guó) Blo+尼龍膜 AMRESCO公司 X光片和X光片盒 天津感光材料公司 激光掃描共聚焦顯微鏡 美國(guó) 超低溫冰箱 SANYOMDF380, 日本 恒溫冷凍切片機(jī) LAUDA, 德國(guó) 石蠟切片機(jī) 上海儀表廠(chǎng)YL3型 JEM1200EX透射電鏡 日本 2197 Multiphor Ⅱ 電泳儀 瑞典 DYYⅡ31A型水平瓊脂電泳槽 北京 紫外線(xiàn)透射儀 北京 PCR引物:由中國(guó)科學(xué)院微生物所合成 大鼠ILIβsense:GAC CTG TTC TTT GAG GCT GAC antisense:TTC ATC TCG AAG CCT GCA GTG 大鼠GAPDH sense:ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG ANTISENSE:CGT AGG ACC CGA TGT GAC TC 大鼠ICAM1 sense:CAG GTA TCC ATC CAT CCC antisense:CTG TTC AGA AGC ACC ACC 大鼠脊髓I/R損傷模型復(fù)制:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:Wistar大鼠,體重180260g,平均220g, 雌雄不限,隨機(jī)分為正常組、單純?nèi)毖M和缺血再灌組。正常組：(僅麻醉動(dòng)物不進(jìn)行阻斷血流量)，單純?nèi)毖M:阻斷血流30min、60min。單純?nèi)毖俟嘟M：根據(jù)所需時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)缺血30min后再灌注30min(n=7)、60min(n=7)、2h (n=7)、4h(n=7)、6h(n=7)、9h(n=7)、12h(n=7)、24h(n =7)組,總計(jì)77只鼠。 手術(shù)方法: 用戊巴比妥納35mg,kg1ip麻醉后將鼠稱(chēng)重采用Zivin法復(fù)制模型，鼠俯臥位置于特制臺(tái)上, 背部剪毛，無(wú)菌操作下，腰椎取背部正中切口，切除L2L 4雙側(cè)椎板,充分顯露L3L4節(jié)段硬脊膜。然后仰臥位于臺(tái)上，腹部剪毛，取腹正中切口。手術(shù)分離腹主動(dòng)脈至腎動(dòng)脈水平，在左腎動(dòng)脈起始部遠(yuǎn)端用ScovilleLewis動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈，根據(jù)所需測(cè)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行阻斷血流，暫時(shí)關(guān)閉腹腔至動(dòng)物蘇醒。然后再次麻醉動(dòng)物，打開(kāi)刀口后松夾恢復(fù)血流，重新關(guān)腹。制成脊髓缺血－再灌注損傷模型，可調(diào)式加熱墊置于動(dòng)物身下，室溫保持22℃,通風(fēng)良好。 脊髓I/R損傷血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 選用Peri Flux PF3激光多普勒血灌流監(jiān)測(cè)儀(Laser Doppler Perfusion Monitor),由瑞典Perimed AB公司生產(chǎn)(Perimed AB,Stockholm, Sweden)。技術(shù)參數(shù)為：激光二極管光源，2mW氦－氖激光(HeNe Laser),波長(zhǎng)為 。光行探頭:PF303不銹鋼探頭( Stainless Steel Probe ,纖維分離(Fibre Separation) 。一臺(tái)瑞典ALR公司(Advanced Logic Research, Inc)生產(chǎn)的386臺(tái)式微機(jī)(Power Flex 20sx) 與激光多普勒Peri Flux PF3相連,通過(guò)專(zhuān)門(mén)的軟件程序PERISOFT進(jìn)行操作,顯示并記錄波形,計(jì)算并存儲(chǔ)血流數(shù)據(jù)。將光纖探頭PR303用微型支架固定于L 3脊髓節(jié)段背側(cè)硬脊膜表面上,觸而不壓,既適于動(dòng)物呼吸又保持測(cè)定區(qū)域恒定。術(shù)野和探頭覆蓋1%瓊脂液(%生理鹽水)。被測(cè)區(qū)域?yàn)楸荛_(kāi)可視血管，距后中央溝12mm局部區(qū)域。血流儀增益(Gain)為1,最大上限頻率 ( Upper Frequency Limit)12Kz,即寬頻(Wide band)狀態(tài)。開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 分鐘后，先測(cè)定腰髓局部基線(xiàn)血流,連續(xù)記錄1020分鐘。然后按缺血和再灌流各時(shí)間段分別連續(xù)測(cè)定血流變化，顯示血流變化的LDF輸出信號(hào)被記錄并存儲(chǔ)在微機(jī)內(nèi)的專(zhuān)門(mén)軟件PERISOFT程序中,確定時(shí)間區(qū)段(Event),計(jì)算平均值。 右頸動(dòng)脈插管，%肝素生理鹽水3ml/kg體內(nèi)抗導(dǎo)管連于四道生理記錄儀和描筆記錄儀(Nihonnden, Japan), 連續(xù)性監(jiān)測(cè)和記錄動(dòng)脈血壓。 病理形態(tài)學(xué)觀察 將實(shí)驗(yàn)組缺血前、缺血30min、缺血 60min 、缺血30min再灌4h、6h,分別在活體狀態(tài)下取同一節(jié)段脊髓行病理學(xué)檢查。 ①石蠟切片光鏡觀察:實(shí)驗(yàn)組大鼠用小剪刀將脊椎管擴(kuò)大,切除周?chē)窠?jīng)根, 將同一節(jié)段脊髓取出，用4%多聚甲醛固定24h 后常規(guī)石蠟 切片,HE染色,光鏡觀察。 ②尼氏染色:緩沖亞甲蘭法：新鮮組織固定于10%甲醛液，按常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片5μm，切片脫蠟至水,蒸餾水洗,入緩沖液亞甲蘭染色內(nèi)染10分鐘, 醋酸鹽緩沖液()分化13分鐘,并在顯微鏡下觀察,至尼氏體清晰為止。4%鉬酸銨液處理35分鐘,蒸餾水洗, 常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)膠封片,尼氏體染成鮮蘭色。 隨機(jī)選取缺血前、缺血30分鐘、再灌流4 小時(shí)各組脊髓前角有核細(xì)胞各30個(gè),應(yīng)用 Luzes F 型圖像分析系統(tǒng)(Japan),在20倍物鏡下測(cè)定尼氏體平均灰度和平均面積。 ③電鏡標(biāo)本制備及觀察按40kgkg1用3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉后,剪開(kāi)腹腔,暴露心臟,經(jīng)左心室穿刺,先用37℃,%生理鹽水心臟灌洗,%戊二醛進(jìn)行灌洗固定。取腰髓在解剖顯微鏡下定位于脊髓前角,經(jīng)1%鋨酸后固定,逐級(jí)乙醇, 丙酮系列脫水,Epon812包埋,半薄切片定位,LKB 超薄切片機(jī)切片,片厚700A。經(jīng)醋酸雙氧鈾檸酸鉛雙重染色, 在日產(chǎn)JEM1200EX透射電鏡下觀察并攝片。 脊髓組織總RNA提取(脊髓組織總RNA的提取按常規(guī)方法進(jìn)行)。 樣品在3ml變性溶液( 6mol/L 異硫氰酸胍、42mmol/L檸檬酸鈉、%Sarcosy)中勻漿。 將2MNaAc()300ul,水飽和酚(pH4.)3ml和氯仿/異戊醇(49:1)600ul與勻漿液輕輕混合,冰上放置15min。 ●4℃12,000rpm離心20min。 ●上清液與等體積酚:異戊醇(25:24:1)混勻。 ●4℃12,000rpm離心10min。重復(fù)抽提一次。 ●離心后的上清液與等體積氯仿：異戊醇(49:1)混合, 4℃12,000rpm離心10min,上清液與等體積的異丙醇混合, 20℃放置1h。 4℃12,000Rpm離心20min,棄上清,75%乙醇1ml 漂洗沉淀,4℃12,%DEPC水溶解沉淀,室溫干燥約15min后,用50μl無(wú) RNase水溶解沉淀, 20℃保存。RNA非變性快速電泳 將電泳槽、梳子和有機(jī)玻璃板用2%SDS浸泡30min, 餾水沖洗干凈,用無(wú)水乙醇干燥。用1%瓊脂糖凝膠()；將RNA和相應(yīng)體積的上樣緩沖液混合，上樣，在10V/cm條件下，快速電泳20min。在紫外透色儀上觀測(cè)結(jié)果，提取完好的RNA電泳圖譜一般有兩條主帶(18S和28S和一條5SRNA次帶,并且,28SRNA條帶約是18SRNA條帶亮度的兩倍。 RNA濃度測(cè)定 取2μl樣品，加入98μl無(wú)菌蒸餾水，在 Pharmacia DNA/RNA測(cè)定儀讀取OD260/OD280值,比較純凈RNA 。 5 RTPCR(總RNA用于cDNA的合成) 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中隨機(jī)寡聚六磷酸核苷合成cDNA的第一鏈。2ug總RNA、4ul 5反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4ul25mmol/ LMgCL2μl10mmol/LdNTP和無(wú)RNasin的去離子水17ul混合,65℃孵育5min 后立即冷卻到0 ℃, 、隨機(jī)寡聚六磷酸核苷1μl及反轉(zhuǎn)錄酶 ,42℃1h,95℃5min,0℃5min后完成反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 ●ICAM1 PCR反應(yīng), 高壓三蒸水、5μl10PCR 緩沖液、4ulmmol/L dNTPs 、5u15mmol/LMgCLICAM1和CAPDH特異性引物各4ul( 50pmmol),反應(yīng)終體積 50ul，上蓋石蠟油,反應(yīng)條件為94℃1min、55℃1min、72℃ 2min, 共35個(gè)循環(huán),最后在72℃延展5min。 ●IL1βPCR反應(yīng)體系中包括IL1β及GAPDH特異性引物各4ul(50pmmol)，反應(yīng)條件為94℃1min，56℃1min、72℃2min共35個(gè)循環(huán),最后在72℃延展5min。GAPDH為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行半定量檢測(cè)。 PCR產(chǎn)物鑒定 取PCR產(chǎn)物810μl,與適量上樣緩沖液混合,%瓊脂糖凝膠()于510V/cm, 電泳30 40min, 在紫外透色儀上觀察結(jié)果并拍照。以日本TaKaRa公司的DNA DL2000作為Marker(2000,1000,750, 250,100bp)。 DIG標(biāo)記核酸探針