illumina測序基礎(chǔ)知識(shí)-資料下載頁
2025-06-19 14:09本頁面
【正文】 。也只有這樣，才會(huì)被激發(fā)光照到，并且發(fā)出它的熒光。PacBio的光學(xué)設(shè)計(jì)中，入射光是幾百納米波長的可見光,光從小孔的底部的玻璃處照到小孔中來。這個(gè)，只有70納米。其它游離的dNTP，只會(huì)非常短暫地進(jìn)入小孔，又很快漂走。所以，這些游離dNTP帶來的的噪音（信號(hào)），就被抑制在很低的水平。啞鈴狀的文庫接下來，我們說一下PacBio的建庫。PacBio的建庫是比較特別的。它的庫是在DNA片段的兩段各接一下發(fā)夾型的接頭。接好了發(fā)夾形的接頭之后，形成的文庫是一個(gè)啞鈴形的文庫。這種啞鈴形狀的文庫有個(gè)好處，那它整個(gè)分子實(shí)際上是一個(gè)圓環(huán)。在測序的過程中它可以周而復(fù)始地進(jìn)行測序，這對(duì)于發(fā)揮PacBio的長讀長的優(yōu)勢(shì)是很有益處的。超長讀長的根本原因 單分子測序接下來，我們說一下PacBio它測序長度優(yōu)勢(shì)的來源。這個(gè)來源，是因?yàn)樗鼫y的是個(gè)單個(gè)分子。相比之下，Illumina或者Ion Torrent測的都是一簇分子?；蛘哒f它們測的都是一大堆分子。當(dāng)它測一大堆分子的時(shí)侯，每個(gè)循環(huán)，多多少少，總有一些分子落后；也多多少少，有些分子超前。這些落后、或者超前的分子，在每個(gè)循環(huán)里面就會(huì)給出噪音。而且，隨著循環(huán)次數(shù)越來越多，落后、和超前的分子也會(huì)越來越多，達(dá)到一定程度的時(shí)侯，噪音就會(huì)很大，大到會(huì)掩蓋掉信號(hào)。當(dāng)噪音大到掩蓋掉信號(hào)的時(shí)侯，實(shí)際上測序就測不準(zhǔn)了。相比之下，PacBio它只有一個(gè)分子，所以，它不存在同步問題。這就讓它可以測到幾千、基至上萬個(gè)BP都可以達(dá)成。堿基判讀準(zhǔn)確率：%接下來，我們要說一下PacBio測序的缺點(diǎn)。最大的缺點(diǎn)是對(duì)堿基的判讀不準(zhǔn)。%。也就是說，它每讀8個(gè)堿基，就有一個(gè)是讀錯(cuò)的。那么它主要的錯(cuò)誤類型是插入。也就是說，它會(huì)多讀一個(gè)堿基。好在，它的這種錯(cuò)誤是隨機(jī)的。也就是說，你在這個(gè)地方再讀一遍，它不一定會(huì)發(fā)生同樣的錯(cuò)誤。那么，對(duì)于同一個(gè)序列，多測幾遍之后，這些偶然誤差，可以被校正過來。讀長限制因素接下來，我們說一下限制PacBio讀長的因素。第一個(gè)因素，就是DNA鏈上出現(xiàn)了缺口。測序過程中是用激光照射來發(fā)出熒光的，所以當(dāng)強(qiáng)光長時(shí)間照射DNA鏈的時(shí)侯，DNA鏈就有可能被照斷掉，出現(xiàn)缺口。當(dāng)酶讀到這個(gè)缺口的時(shí)侯，酶就從模板鏈上掉下來。這時(shí)侯，測序就終止了。這是第一種可能。第二種可能，是光線照射情況下，酶有可能會(huì)變性，當(dāng)酶發(fā)生了變性之后，失去了聚合酶的功能，這時(shí)侯，測序也會(huì)終止。第三個(gè)限制因素，是文庫本身的長度。因?yàn)橐銎伍L度大于20~30K的文庫，是有相當(dāng)大的困難的，所以，文庫本身的質(zhì)量，在一定程度上，也限制了PacBio的讀長。數(shù)據(jù)通量在高通量測序當(dāng)中，測序的通量，是一個(gè)很重要的技術(shù)指標(biāo)。~。在PacBio測序中，芯片上的小孔數(shù)是第一個(gè)絕對(duì)的、限制性的因素。目前的芯片，是有15萬個(gè)小孔。但這15萬個(gè)小孔中，并不是每一個(gè)都能產(chǎn)生有效數(shù)據(jù)的。這里，我們要說一下，測序復(fù)合物和玻璃底板結(jié)合的方式所謂的測序復(fù)合物，就是聚合酶、測序模板、測序引物這三者組成的復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物是通過聚合酶連接到玻璃底板上的。這個(gè)連接方式，首先在聚合酶上標(biāo)上生物素。然后，在小孔的玻璃底板上標(biāo)上鏈霉親合素。實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中，利用生物素和鏈霉親合素的親合力，把兩者（聚合酶、和玻璃底板）結(jié)合到一塊兒。在實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中，這個(gè)測序復(fù)合物是被隨機(jī)地鋪撒到這15萬個(gè)小孔中的。因?yàn)槭请S機(jī)地鋪撒進(jìn)去的，所以，有多少個(gè)小孔里面正好有一個(gè)測序復(fù)合物，是符合泊松分布的。最理想的情況下，是有1/3的小孔是正好有一個(gè)測序復(fù)合物。這時(shí)侯，還有約1/3的小孔是空的，還剩下約1/3的小孔是有2個(gè)或者3個(gè)以上的測序復(fù)合物被種進(jìn)去?？盏倪@些小孔，因?yàn)榻酉聛硭鼪]有聚合反應(yīng)發(fā)生，也沒有信號(hào)，那當(dāng)然是廢掉了。那么有2個(gè)復(fù)合物種進(jìn)去、或者有更多復(fù)合物種進(jìn)去的這些小孔，因?yàn)樗a(chǎn)生的信號(hào)會(huì)非常的雜亂，所以，這些孔實(shí)際上也是沒用的。它產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，在接下來的數(shù)據(jù)分析當(dāng)中，是會(huì)被去掉的。一張芯片有15萬個(gè)孔，其中1/3有效，也就是說，有效的孔數(shù)是5萬個(gè)。然后乘以它目前的平均測長，大概8千多個(gè)堿基，所以，一張芯片，比較理想的情況下。直接測DNA修飾PacBio在測序當(dāng)中，可以直接測到堿基的被修飾狀態(tài)。因?yàn)楫?dāng)聚合物，遇到模板上有甲基化的A、C等堿基，它測序的速度就明顯地放慢。而且它的光譜特征會(huì)發(fā)生改變。這樣，就可以判斷，這個(gè)位置上的DNA被甲基化了。GC Bias 很小PacBio測序還有另外一個(gè)好處，就是它GC Bias很小。什么叫GC Bias呢？就是我們知道，所有的PCR的過程，如果模板里面G、C（堿基）的含量比較高，PCR的效率就比較低。反之，A、T（堿基）的比例比較高，則它PCR的效率比較高。傳統(tǒng)的建庫當(dāng)中，一般都有大量的PCR的過程。它導(dǎo)致的一個(gè)結(jié)果，就是G、C含量高的那些片段，它讀到的Reads數(shù)，就會(huì)比較少。PacBio它的好處，就是它的建庫過程中沒有PCR過程，所以，它帶來一個(gè)直接的好處：就是它測序過程當(dāng)中，GC Bias很少。也就是說，那些高GC的片段，有和低GC的片段差不多的概率被讀到。測序速度極快高通量測序的另外一個(gè)指標(biāo)，就是測序的速度。PacBio的測序速度取決于酶反應(yīng)的速度。目前PacBio用的這個(gè)酶，大概1秒鐘是合成3個(gè)堿基，1個(gè)小時(shí)大概就可以合成1萬多個(gè)堿基，3個(gè)小時(shí)可以合成3萬多個(gè)堿基。到3萬多個(gè)堿基之后，基本上繼續(xù)在讀的Reads，已經(jīng)幾乎沒有了，所以，3個(gè)小時(shí)之后，測序基本就完成了。1個(gè)Run讀三個(gè)小時(shí)，相對(duì)于Illumina的測序速度來說，是非?？斓?；相對(duì)于Ion Torrent的測序速度來說，也相對(duì)要快一點(diǎn)點(diǎn)。所以，PacBio是一種非?？斓臏y序方式。21
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1