產(chǎn)綠原酸金銀花內(nèi)生菌的分離研究論文-資料下載頁
2025-06-18 12:49本頁面
【正文】 度。表 9 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化結(jié)果編號因素結(jié)果1碳源蔗糖2氮源蛋白胨3溫度28℃4pH通過對發(fā)酵條件的摸索，得到基本發(fā)酵培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，考慮到蔗糖價格便宜，且在實驗過程中與葡萄糖起到相同的實驗作用，故選擇主要碳源為蔗糖，主要氮源為蛋白胨，溫度選擇在28℃,。表10 四因素三水平正交試驗試驗號ABCD菌絲干重綠原酸相對含量列號蔗糖蛋白胨pH值溫度mg/mLmg/ml111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3K1K2K3表11 發(fā)酵條件對菌絲干重影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖2*蛋白胨2pH值2溫度2表12 發(fā)酵條件對綠原酸產(chǎn)量影響的方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性葡萄糖2*蛋白胨2pH值2*溫度2由表112可知，9個正交試驗中，以A2B1C2D3為最佳組合，%,%，溫度30℃時，菌絲重量與綠原酸含量相對含量均達到了最大值。通過比較單因素實驗優(yōu)化后的結(jié)果，采用最佳組合為馬鈴薯培養(yǎng)基，%，%,，培養(yǎng)溫度為30℃的條件。初始培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，自然pH值，同時在30℃的條件下培養(yǎng)菌株B415，；，正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基下菌絲最大生長量增大了4倍。經(jīng)過單因素和正交試驗的優(yōu)化，使得菌絲重量和綠原酸含量都得到了一定的提高，初步選擇出了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。 抑菌實驗結(jié)果表13 內(nèi)生真菌抑菌圈直徑（cm）三組重復(fù)內(nèi)生菌指示菌金黃色葡萄球菌（cm）大腸桿菌(cm)綠膿桿菌(cm)A324＋＋＋＋＋B415＋＋－＋＋B431＋＋＋＋＋＋表示抑菌圈直徑≥10mm；＋表示抑菌圈直徑10mm；－ 表示無抑菌活性；實驗設(shè)定三組重復(fù)，＋＋表示抑菌圈直徑≥10mm；＋表示抑菌圈直徑＜10mm；－表示無抑菌活性；根據(jù)實驗結(jié)果可知，菌株對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強的抑菌活性，而對大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性；菌株A32B415表現(xiàn)出的抑菌活性較強，菌株B431表現(xiàn)的抑菌活性較弱；分析原因可能是菌株B431發(fā)酵液中綠原酸含量較低造成抑菌圈直徑較小。金銀花提取液A324B415B431圖23 金銀花內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌抑菌結(jié)果5 結(jié)論與討論 通過對金銀花內(nèi)生真菌的分離，從其不同組織部位共分離得到內(nèi)生真菌79株，其中從根中分離得到21株，莖部分離得到25株，葉中分離得到17株，花蕾中分離得到13株，表明了在健康的金銀花組織內(nèi)部存在著豐富的內(nèi)生真菌，而其種類和數(shù)量則與其存在部位有關(guān)。 本實驗采用了常規(guī)形態(tài)學(xué)與顯微鑒定相結(jié)合的方法對金銀花內(nèi)生真菌進行了鑒定，確定了其歸屬，但還需要在后期的實驗過程中利用測定內(nèi)生真菌DNA中ITS序列的方法進行進一步的驗證，為以后進一步掌握和研究金銀花內(nèi)生真菌奠定基礎(chǔ)。 TLC分析顯示三株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液與綠原酸對照品Rf值相近，HPLC進一步分析顯示三株內(nèi)生真菌發(fā)酵液與對照品有相同或者相近的保留時間。綜合TLC與HPLC分析，推斷三株內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中可能含有綠原酸類成分。 內(nèi)生真菌在發(fā)酵過程中，不同的發(fā)酵溫度、pH值、碳源和氮源濃度都會影響其有效成分的種類及含量。相應(yīng)的，也很可能會產(chǎn)生不同種類的代謝產(chǎn)物。 在金銀花內(nèi)生真菌抑菌學(xué)實驗中，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌為指示菌，通過紙片法法對分離得到的能夠產(chǎn)生綠原酸金銀花內(nèi)生真菌進行菌株抑菌學(xué)實驗，以驗證這些分離得到的金銀花內(nèi)生菌菌株是否具有抑菌活性。根據(jù)實驗結(jié)果可知，分離得到的A324， B415，B431，這3株內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌具有較強的抑菌活性，而對大腸桿菌則表現(xiàn)出較弱的抑菌活性。6 展望 通過溶磷菌、溶鉀菌、固氮菌與產(chǎn)綠原酸、木犀草苷內(nèi)生真菌發(fā)酵液按比例組合對不同時期金銀花進行灌根和噴施的方法進行研究，并對金銀花生物學(xué)性狀進行測定。篩選出能使金銀花活性成分增加和抗病原菌的菌肥配方。 傳統(tǒng)的金銀花中有效成分綠原酸的提取工藝大多采用水提取或有機溶劑提取，這些工藝存在提取能耗大、效率低、雜質(zhì)多、收率少，資源不能得到充分利用溫度過高，會造成綠原酸功效與產(chǎn)量降低等問題?；谀壳敖疸y花的生產(chǎn)和需求現(xiàn)狀，利用其內(nèi)生真菌來生產(chǎn)其主要活性成分，為人類突破植物資源周期長、產(chǎn)量低、不可再生等限制。如果能研究出使金銀花有效藥用成分工廠化生產(chǎn)的方法——發(fā)酵工程技術(shù)。也就能緩解當(dāng)前金銀花供不應(yīng)求的情況。參考文獻[1] 項勇，崔京霞，呂安國．東北紅豆杉內(nèi)生真菌的分離和篩選[J]．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，30(3)：3034．[2] 馬天有，董兆麟．植物分離產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌的研究[J]．西北大學(xué)學(xué)報，1999．29(1)：4749．[3] 項勇，[J],東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報 ，2002,30（2）：3034[4] 李海燕．一種桃兒七內(nèi)生真菌的分離初報．云南大學(xué)學(xué)報，1999，21(3):243[5] 一株產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌發(fā)酵條件的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報[6] [M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979. 37
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