【正文】 05nm處檢測(cè)的要求，因此，綜合來看，乙腈水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇水系統(tǒng)。 在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。 反相色譜中，如果要在相同的時(shí)間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時(shí)其沖洗強(qiáng)度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度配比有如下關(guān)系： C乙腈＝ 2甲醇＋ C四氫呋喃＝ C為不同有機(jī)溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強(qiáng)度相當(dāng)于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強(qiáng)度。3．流動(dòng)相的pH值 采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。4．流動(dòng)相的脫氣 HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。 溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。 除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。 離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。 在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)。 一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。5．流動(dòng)相的濾過 amp。micro。m（amp。micro。m）濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明已濾過）。 用濾膜過濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機(jī)相濾膜?，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。6．流動(dòng)相的貯存 流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。 磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。7．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題 鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CClCHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶?？傊u代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)產(chǎn)生類似問題。8．HPLC用水 HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測(cè)器基線的校正和反相柱的洗脫。 進(jìn)行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時(shí)，沒有有機(jī)物污染是非常重要的。測(cè)高錳酸鉀顏色保留時(shí)間的定性方法反應(yīng)慢，對(duì)很低水平的有機(jī)物（對(duì)HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量?？傆袡C(jī)碳(TOC)分析儀（把有機(jī)物氧化成CO2，測(cè)游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機(jī)物的測(cè)定。I類水標(biāo)準(zhǔn)：NCCLSASTM電阻率，MΩcm，25℃，最小硅酸鹽，mg/L，最大微粒，amp。micro。m濾器微生物，CFU/ml10分三檔美國藥典24版（2000年）要求TOC＜ mg/L（ mg/L），電導(dǎo)率在室溫pH 6時(shí)≤ amp。micro。S/cm（即≥ MΩcm）。HPLC級(jí)水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~、。增加不揮發(fā)物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。V．HPLC應(yīng)用一、樣品測(cè)定1．流動(dòng)相比例調(diào)整：由于我國藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒有規(guī)定柱的長度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時(shí)幾乎都須調(diào)整流動(dòng)相（按經(jīng)驗(yàn)，主峰一般應(yīng)調(diào)至保留時(shí)間為6~15分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請(qǐng)注意充分平衡柱。2．樣品配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。3．記錄時(shí)間：第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長時(shí)間內(nèi)才洗脫出來，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。4．進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10ml，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ml、20ml和50ml），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度）5．計(jì)算：由于有些對(duì)照品標(biāo)示含量的方式與樣品標(biāo)示量不同，有些是復(fù)合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標(biāo)示，檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)注意。6．儀器的使用：①流動(dòng)相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請(qǐng)重新濾過。②柱在線時(shí)，一般不超過1ml/min，反之亦然。否則會(huì)使柱床下塌，叉峰。柱不線時(shí)，（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。③安裝柱時(shí)，請(qǐng)注意流向，接口處不要留有空隙。④樣品液請(qǐng)注意濾過（注射液可不需濾過）后進(jìn)樣，注意樣品溶劑的揮發(fā)性。⑤測(cè)定完畢請(qǐng)用水沖柱1小時(shí)，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水以低流速（~）沖洗過夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需要特別注意的是：對(duì)于含碳量高、封尾充分的柱，應(yīng)先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。⑥沖水的同時(shí)請(qǐng)用水充分沖洗柱頭（如有自動(dòng)清洗裝置系統(tǒng)，則應(yīng)更換水）。二、方法研究1．波長選擇：首先在可見紫外分光光度計(jì)上測(cè)量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測(cè)量波長，如最靈敏的測(cè)量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，HPLC測(cè)定的面積將會(huì)很小。2．流動(dòng)相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇水流動(dòng)相。附件：高效液相色譜法（HPLC）復(fù)核細(xì)則一、對(duì)起草單位的要求：1．HPLC法用于藥品的有關(guān)物質(zhì)檢查或含量測(cè)定時(shí)，需提供建立HPLC法的依據(jù)及參考文獻(xiàn)。2．應(yīng)對(duì)建立的方法進(jìn)行論證，按照中國藥典2000年版二部凡例與附錄收載的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證項(xiàng)下所列的要求進(jìn)行試驗(yàn)。3．建立方法時(shí)，應(yīng)考慮下列事項(xiàng)：①首選填料為十八烷基鍵合硅膠，并至少對(duì)兩根不同品牌的色譜柱進(jìn)行比較試驗(yàn)，其中一根為國產(chǎn)柱。②流動(dòng)相首選甲醇水系統(tǒng)，應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，如為堿性藥物，流動(dòng)相的pH值應(yīng)為7~8；如為酸性藥物，流動(dòng)相的pH值應(yīng)為3~4。③盡可能選用流動(dòng)相作為溶劑，如未能選用，應(yīng)說明原因。④內(nèi)標(biāo)物應(yīng)首選易得到的純度較高的化學(xué)試劑或?qū)φ掌?，?yīng)與待測(cè)物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，理化性質(zhì)接近，峰的響應(yīng)值相當(dāng)，另應(yīng)考慮對(duì)照品的來源問題。⑤檢測(cè)器首選UV檢測(cè)器。4．采用HPLC法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)，如雜質(zhì)峰的響應(yīng)值與主成分峰的響應(yīng)值相差太大，應(yīng)首選自身對(duì)照法，而不宜選用面積歸一化法。5．HPLC法用于原料藥的含量測(cè)定。如以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量，應(yīng)考慮內(nèi)標(biāo)物是否含有干擾供試品的雜質(zhì)；如以外標(biāo)法測(cè)定含量，對(duì)照品與供試品應(yīng)各取樣2份，對(duì)照晶溶液各進(jìn)樣3次，供試品溶液各進(jìn)樣2次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（％）。二、對(duì)復(fù)核單位的要求：1．按照起草單位提供的色譜條件與方法進(jìn)行復(fù)核。2．當(dāng)HPLC法用于有關(guān)物質(zhì)的檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行最低撿出量試驗(yàn)。3．應(yīng)考慮對(duì)同一樣品分析結(jié)果的重現(xiàn)程度、方法的可行性，并作出評(píng)價(jià)。高效液相色譜儀中反相HPLC柱子的清潔和再生【字體：大 中 小】 反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保留方式分離。 固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相（例如苯基－己基）、末端封閉和非末端封閉種類和極性嵌入相－也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色譜，包括聚合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無機(jī)－有機(jī)混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。 反相色譜柱利用各種流動(dòng)相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時(shí)候這些添加物有可能會(huì)污染鍵合相表面。 硅膠表面因?yàn)橛兄杷I合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別是堿性成分。，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時(shí)候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。 使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時(shí)才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填表面并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來保護(hù)HPLC柱子，某些分析物－基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。 當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會(huì)有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓問題。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來的操作條件。這部分的柱子觀察將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來的或差不多原來的狀態(tài)。因?yàn)殒I合硅膠柱子是最受歡迎的，我重點(diǎn)講述這種柱子。最后，我將討論別的反相柱子的清潔步驟。 什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些可能在使用時(shí)與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時(shí)就被沖出色譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測(cè)器檢測(cè)到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保留而且流動(dòng)相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。這些行為通常只有通過平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。 有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理。保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。 清洗硅膠鍵合柱子 再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コ?。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過多次操作以后的色譜柱用90～100％的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個(gè)體積可以清除污染物。（表2列舉了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相應(yīng)柱子沖洗的體積。）例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）。沖洗5～10個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。 有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒法