【正文】 期：一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高花蕾：選擇完全未開放的花蕾親本植株的生長條件、材料的低溫預處理以及接種密度等對誘導成功率都有一定影響材料的選?。哼x擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色材料的消毒接種和培養(yǎng)：滅菌后的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥（否則接種后容易從受傷部位長生愈傷組織），同時還要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成，通常每瓶接種花藥7～10個,培養(yǎng)溫度控制在25℃左右,～30天培養(yǎng)后,會發(fā)現(xiàn)花藥開裂,長出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進一步分化出再生植株。如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。還需要對培養(yǎng)出來的植株做進一步的鑒定和篩選。植物組織培養(yǎng)技術與花藥培養(yǎng)技術的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾；花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對培養(yǎng)基配方的要求更為嚴格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。專題五 ＤＮＡ和蛋白質(zhì)技術課題一　ＤＮＡ的粗提取與鑒定提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點？要使DNA溶解，需要使用什么濃度？要使DNA析出，又需要使用什么濃度？；較高濃度可使DNA溶解；。在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特別是95％冷卻酒精），但細胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到什么目的？將DNA和蛋白質(zhì)進一步分離。提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應選用怎樣的酶和怎樣的溫度值？蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會對DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而DNA不會變性。補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術中DNA變性溫度在95℃。洗滌劑在提取DNA中有何作用？洗滌劑將細胞膜上的蛋白質(zhì)，從而瓦解細胞膜。當鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定？在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍色。原理總結(jié)：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。實驗材料的選取不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。破碎細胞，獲取含DNA的濾液若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？在雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。在以上實驗中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過濾時應當選用（濾紙、尼龍布）。血細胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA物質(zhì)；選用尼龍布進行過濾。在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什么？研磨不充分產(chǎn)生什么結(jié)果？破碎細胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會使DNA的提取量減少，影響實驗結(jié)果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。具體做法。10mL雞血＋20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液去除濾液中的雜質(zhì)為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進一步提純DNA。方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。析出與鑒定在濾液中仍然含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的DNA呈何顏色？濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？具體做法。試管2支，編號甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化實驗操作制備雞血細胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心↓破碎細胞，釋放DNA… 加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌↓→過濾，除去細胞壁、細胞膜等。溶解核內(nèi)DNA………… 加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌↓DNA析出……………… ，過濾，在溶解到2mol/L溶液中↓→除去細胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。DNA初步純化………… 與等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鑒定……………… 二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍色注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速攪拌）；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。18