【正文】 雙鏈區(qū)，結果是敏感的。當滲透壓增加時會導致micRNA的合成，而關閉了OmpF mRNA的翻譯。無論是在原核還是真核細胞中，看來似乎micRNA的合成是足可以使其靶RNA失活。，它們可以阻止特殊的靶基同的表達。在λ噬菌體的生活周期中也存在著這種反義調控。（見第十七章）反義基因已被導入到真核細胞中。方法是將靶基因反向插入重組載體的啟動子后面，再導入細胞，這便稱為反義技術（圖1655）當將胸苷激酶（tK）的反義基因導入細胞，它將抑制細胞本身的tK 基因的合成。由于其作用和反義RNA的數(shù)量有關，因此常常并不能起到完全抑制的作用。但看來過量的反義RNA應能有效阻止靶順序的翻譯。實際上反義RNA不需和mRNA等長，只要靶mRNA的一小部分結合可達到調節(jié)了。一般只要100堿基長的靶的RNA 5ˊ區(qū)域的反義RNA就可以有效地抑制其翻譯。反義技術抑制表達是在什么水平呢？原則上說它可能阻止一些基因的轉錄，RNA的加工，或者mRNA的翻譯。抑制作用往往依賴于RNARNA雙鏈分子的形成。但抑制作用既能發(fā)生核中，也能發(fā)生在胞質中。在培養(yǎng)細胞中有義反義RNA雙鏈可以在核中形成，阻止正常的加工或者RNA的轉錄。另一種情況下是將反義RNA注入到細胞質中，通過和mRNA 5ˊ端區(qū)域形成雙鏈來抑制翻譯。此技術常常是任意關閉某些基因的有效方法，例如導入反義RNA來研究基因的調控。這種技術的一種延伸就是把反義基因置于啟動子的控制之下，研究其本身的調節(jié)。靶基可能被關閉，也可能不受反義RNA產物的調節(jié)。反義技術在應用上有著廣闊的前景?，F(xiàn)已應用于抗腫瘤，抗病毒的治療研究，對某些遺傳病甚至寄生蟲病的治療（如錐蟲?。┮部赡馨l(fā)揮作用。但農業(yè)上除了培養(yǎng)抗病毒植株外，現(xiàn)已應用于果蔬運輸?shù)谋ｕr以及珍奇花卉的培育。嚴緊反應當細菌發(fā)現(xiàn)它們自己生長在饑餓的條件下，缺乏維持蛋白質合成的氨基酸時，它們將大部分活性區(qū)域都關閉掉。此就稱為嚴緊反應(strigent response)，這是它們抵御不良條件，保存自己的一種機制。細菌通過僅僅維持最低量的活性來節(jié)約其資源，直到條件改善時，它們又恢復活動，所有代謝區(qū)域也都活躍起來。 嚴緊反應導致rRNA和tRNA合成大量減少（1020倍），使RNA的總量下降到正常水平的510%，部分種類的mRNA的減少，導致mRNA總合成量減少約3倍。而蛋白質除解的速度增加,很多代謝進行調整，顯然核苷酸，碳水化合物，肽類等的合成都隨之減少。嚴緊反應導致兩種特殊核苷酸積聚：(1)ppGpp—四磷酸鳥苷（在G的539。和339。位點各附著兩個磷酸）。(2) pppGpp—五磷酸鳥苷（鳥苷539。一三磷酸339。二磷酸）。人們最初發(fā)現(xiàn)細菌在氨基酸饑餓時，出現(xiàn)兩種特殊的核苷酸，其電泳的遷移率和一般的核酸不同，感到很奇怪，就稱之為“魔斑Ⅰ”和“魔斑Ⅱ”，后來發(fā)現(xiàn)魔斑Ⅰ便是ppGpp，魔斑Ⅱ是pppGpp。這些鳥苷是典型的小分子效應物，預期它們的功能是和靶蛋白結合改變它們的活性，有時它們被稱為（p）ppGpp。（p）ppGpp的功能是調節(jié)細胞活性大分子的協(xié)調性。它們的產物是由兩種途徑來控制的。在嚴峻的條件下嚴緊反應可以觸發(fā)(p)ppGpp的增加。一些未知因素的調節(jié)也會出現(xiàn)（p）ppGpp水平與細菌生長速度之間的反向協(xié)調。任何一種氨基酸的缺乏或使任何氨基酰tRNA合成酶的失活突變都足以起始嚴緊反應，此表明嚴緊反應的觸發(fā)器是位于核糖體A位點中的空載tRNA。當然在正常條件下僅有氨基酸t(yī)RNA在EETu的作用下位于A位點。但當氨基酸t(yī)RNA對一個特殊的密碼子不能作出有效反應時，空載tRNA便能得以進入，當然這就阻斷了核糖體的進程，而觸發(fā)了一個空轉反應（idiling reaction）。通過空轉反應產生（p）ppGpp的有關成分已通過松馳型突變（relaxed(rel)mutants）被鑒別出來。rel突變能去除嚴緊反應。這樣氨基酸的饑餓便不會導致合成任何穩(wěn)定的RNA或者通常見到的各種其它的反應。松馳突變大部分基因位點位于relA基因中，此基因編碼一種蛋白，稱為嚴緊因子（stringent factor）。此因子和核糖體結合，雖然它的總量較低－每200核糖體低于1分子的嚴緊因子。因此似乎只有在核糖體少量存在時才能產生嚴緊反應。 從嚴緊反應中分離的核糖體在體外能合成ppGpp和pppGpp。A位點是通過一個空載tRNA對密碼子的特異反應所提供的。從松馳突變體中提取的核糖體不能執(zhí)行嚴緊反應，但若有嚴緊因子存在它們是能合成(p)ppGpp的。圖1658表示（p）ppGpp的合成途徑，嚴緊因子（RelA）是一種（p）ppGpp的合成酶，它可以催化ATP將焦磷酸加到另一個GTP或GDD的339。位點。當條件恢復到正常時，ppGpp怎樣被去除的呢？有一個基因叫做spoT，它編碼一種酶，主要的作用是催化ppGpp的降解。這種酶的活性導致ppGpp迅速降解其半衰期為20秒左右，因此(p)ppGpp合成結束時，嚴緊反應很快就消除。spoT突變會提高ppGpp的水平，并會慢慢增加。RelA酶用GTP作為底物的頻率是較高的，所以pppGpp的產生是占優(yōu)勢的。但pppGpp可以通過各種酶轉化為ppGpp，其中翻譯因子EFTu和EFG是可以去磷酸化的。通過pppGpp產生ppGpp是最通用的路線，而ppGpp通常就是嚴緊反應的效應物。圖1659表明核糖體對空載tRNA進入的反應與正常蛋白質合成的比較。當ETTu將氨基酸t(yī)RNA放在A位點時肽鏈隨著核糖的移動而合成；但是當空載tRNA在A位點與密碼子配對時，核糖體仍保持不動，并進行了空轉反應。提純的RelA酶它本身實際是沒有活性的。而在核糖體存在時它才有活性。它的活性是由核糖體在合成蛋白中的狀態(tài)所控制的。此控制的特點是通過另一個位點的松馳突變而顯示，此突變原來稱為relC，現(xiàn)在弄清楚它就是編碼50S亞基L11蛋白的rp1K基因。此蛋白位于A位點和P位點的附近，它在此位置對合適的配對作出反應，空載tRNA是在A位。L11蛋白或某些其它成分構象的改變可能激活RelA酶，這樣空轉反應就代替了肽酰tRNA的轉位。（p）ppGpp合成的每條途徑都觸發(fā)空載tRNA從A位點釋放出來，因此（p）ppGpp的合成是一種對空載tRNA水平的持續(xù)反應。在饑餓條件下，當氨基酰tRNA不能對A位點的密碼子作出有效反應時，核糖體便停滯不前?？蛰dtRNA的進入，觸發(fā)了(p)ppGpp分子的合成。并將空載tRNA排出，使A位重新空出來。核糖體是恢復多肽的合成，還是進行另一輪的空轉反應,關鍵是取決于氨基酰tRNA是否有效。ppGpp有什么作用呢？它是一系列反應的效應物，包括抑制轉錄。許多反應已被報導，其中2個較為突出：（1）rRNA操縱子的啟動子其轉錄起始被嚴緊反應特異抑制了。嚴緊調節(jié)的啟動子發(fā)生突變能消除嚴緊控制，表明此效應需要和特異啟動子順序相互作用；（2）很多或大部分模板的轉錄延伸階段被ppGpp縮短了，此是RNA聚合酶停頓的增加而引起的。此效應反應了在細胞內加入ppGpp時轉錄效率普遍下降?，F(xiàn)在尚不清楚這種抑制的特異性，若不同的操縱子之間這種抑制的變化很大，某些操縱子抑制作用更為顯著的活，也是不足為奇的。異常核苷酸在兩種控制系統(tǒng)中都能發(fā)揮作用是很有趣的現(xiàn)象。這兩種途徑的抑制對細菌來說是特異的。在營養(yǎng)缺乏時烏苷觸發(fā)了嚴緊反應。而在缺乏葡萄糖時，cAMP觸發(fā)碳源利用的轉換。圖1637表示（p）ppGpp的合成途徑，嚴緊因子（RelA）是一種（p）ppGpp的合成酶，它可以催化ATP將焦磷酸加到另一個GTP或GDP的3′位點。當條件恢復到正常時，有一個基因叫做spoT，它編碼一種酶，主要的作用是催化ppGpp迅速降解，其半衰期為20秒左右。因此(p)ppGpp合成結束時，嚴緊反應很快就消除。spoT突變會提高ppGpp的水平，并會慢慢增加?！? RelA酶用GTP作為底物的頻率是較高的，所以pppGpp的產生是占優(yōu)勢的。但pppGpp可以通過各種酶轉化為ppGpp。通過pppGpp產生ppGpp是最通用的路線，而ppGpp通常就是嚴緊反應的效應物?！? 圖1638表明核糖體對空載tRNA進入的反應與正常蛋白質合成的比較。當ETTu將氨基酸t(yī)RNA放在A位點時肽鏈隨著核糖的移動而合成；但是當空載tRNA在A位點與密碼子配對時，核糖體仍保持不動，并進行了空轉反應。提純的RelA酶它本身實際是沒有活性的。而在核糖體存在時它才有活性。它的活性是由核糖體在合成蛋白中的狀態(tài)所控制的。此控制的特點是通過另一個位點的松弛突變而顯示，此突變原來稱為relC，現(xiàn)在弄清楚它就是編碼50S亞基L11蛋白的rp1K基因。此蛋白位于A位點和P位點的附近，它在此位置對合適的配對作出反應，空載tRNA是在A位。L11蛋白或某些其他成分構象的改變可能激活RelA酶，這樣空轉反應就代替了肽酰tRNA的轉位?！。╬）ppGpp合成的每條途徑都觸發(fā)空載tRNA從A位點釋放出來，因此（p）ppGpp的合成是一種對空載tRNA水平的持續(xù)反應。在饑餓條件下，當氨基酰tRNA不能對A位點的密碼子作出有效反應時，核糖體便停滯不前?？蛰dtRNA的進入，觸發(fā)了(p)ppGpp分子的合成。并將空載tRNA排出，使A位重新空出來。核糖體是恢復多肽的合成，還是進行另一輪的空轉反應,關鍵是取決于氨基酰tRNA是否有效?！? ppGpp有什么作用呢？它是一系列反應的效應物，包括抑制轉錄（圖1639）。許多反應已被報導，其中2個較為突出：①rRNA操縱子的啟動子其轉錄起始被嚴緊反應特異抑制了。嚴緊調節(jié)的啟動子發(fā)生突變能消除嚴緊控制，表明此效應需要和特異啟動子序列相互作用；②很多或大部分模板的轉錄延伸階段被ppGpp縮短了，此是RNA聚合酶停頓的增加而引起的。此效應反應了在細胞內加入ppGpp時轉錄效率普遍下降?，F(xiàn)在尚不清楚這種抑制的特異性，若不同的操縱子之間這種抑制的變化很大，某些操縱子抑制作用更為顯著的活，也是不足為奇的。異常核苷酸在兩種控制系統(tǒng)中都能發(fā)揮作用是很有趣的現(xiàn)象。這兩種途徑的抑制對細菌來說是特異的。在營養(yǎng)缺乏時烏苷觸發(fā)了嚴緊反應。而在缺乏葡萄糖時，cAMP觸發(fā)碳源利用的轉換。ppGpp有什么作用呢？它是一系列反應的效應物，包括抑制轉錄（圖1639）。許多反應已被報導，其中2個較為突出：①rRNA操縱子的啟動子其轉錄起始被嚴緊反應特異抑制了。嚴緊調節(jié)的啟動子發(fā)生突變能消除嚴緊控制，表明此效應需要和特異啟動子序列相互作用；②很多或大部分模板的轉錄延伸階段被ppGpp縮短了，此是RNA聚合酶停頓的增加而引起的。此效應反應了在細胞內加入ppGpp時轉錄效率普遍下降?，F(xiàn)在尚不清楚這種抑制的特異性，若不同的操縱子之間這種抑制的變化很大，某些操縱子抑制作用更為顯著的活，也是不足為奇的?！? 異常核苷酸在兩種控制系統(tǒng)中都能發(fā)揮作用是很有趣的現(xiàn)象。這兩種途徑的抑制對細菌來說是特異的。在營養(yǎng)缺乏時烏苷觸發(fā)了嚴緊反應。而在缺乏葡萄糖時，cAMP觸發(fā)碳源利用的轉換。mRNA穩(wěn)定性對翻譯的調控′—3′外切活性的核糖酸酶，降解mRNA有的酶有兩種：RNaseII和多核苷酸磷酸化酶，這兩種酶都是3′—5′的外切酶，但mRNA的二級結構可以阻遏這些酶的作用。 ，發(fā)現(xiàn)一種高度保守的反向重復順序（IR），對mRNA的穩(wěn)定性起著重要的作用。~1000拷貝。它們有的位于3′端非編碼區(qū)，有的在基因間的間隔區(qū)。IR的存在提供了形成莖環(huán)結構的可能性，從而增加mRNA上游部分的半衰期，對下游部分影響不大。這是由于IR的存在可以防止3′－5′外切酶的降解作用。因此在多順序反子的操縱子中，基因間的IR可以特異地使其某些基因上游mRNA得到保護。（圖1640）。malE和malF雖然同在一個操縱子中，而且緊密連鎖，但malE的產物(周質結合蛋白)要比malE的產物(一種40KDa的內膜蛋白)的含量高2040倍。這可能由于malG和malF的mRNA區(qū)域不如malE的區(qū)域穩(wěn)定，在malE 3′端有2個IR存在，可以形成莖環(huán)保護其不被外切酶所降解。若IR區(qū)缺失，那么malE產物的量就會減少到原來的1/9。27 / 27