【正文】 雙鏈區(qū)，結(jié)果是敏感的。當(dāng)滲透壓增加時會導(dǎo)致micRNA的合成，而關(guān)閉了OmpF mRNA的翻譯。無論是在原核還是真核細(xì)胞中，看來似乎micRNA的合成是足可以使其靶RNA失活。，它們可以阻止特殊的靶基同的表達(dá)。在λ噬菌體的生活周期中也存在著這種反義調(diào)控。（見第十七章）反義基因已被導(dǎo)入到真核細(xì)胞中。方法是將靶基因反向插入重組載體的啟動子后面，再導(dǎo)入細(xì)胞，這便稱為反義技術(shù)（圖1655）當(dāng)將胸苷激酶（tK）的反義基因?qū)爰?xì)胞，它將抑制細(xì)胞本身的tK 基因的合成。由于其作用和反義RNA的數(shù)量有關(guān)，因此常常并不能起到完全抑制的作用。但看來過量的反義RNA應(yīng)能有效阻止靶順序的翻譯。實際上反義RNA不需和mRNA等長，只要靶mRNA的一小部分結(jié)合可達(dá)到調(diào)節(jié)了。一般只要100堿基長的靶的RNA 5ˊ區(qū)域的反義RNA就可以有效地抑制其翻譯。反義技術(shù)抑制表達(dá)是在什么水平呢？原則上說它可能阻止一些基因的轉(zhuǎn)錄，RNA的加工，或者mRNA的翻譯。抑制作用往往依賴于RNARNA雙鏈分子的形成。但抑制作用既能發(fā)生核中，也能發(fā)生在胞質(zhì)中。在培養(yǎng)細(xì)胞中有義反義RNA雙鏈可以在核中形成，阻止正常的加工或者RNA的轉(zhuǎn)錄。另一種情況下是將反義RNA注入到細(xì)胞質(zhì)中，通過和mRNA 5ˊ端區(qū)域形成雙鏈來抑制翻譯。此技術(shù)常常是任意關(guān)閉某些基因的有效方法，例如導(dǎo)入反義RNA來研究基因的調(diào)控。這種技術(shù)的一種延伸就是把反義基因置于啟動子的控制之下，研究其本身的調(diào)節(jié)。靶基可能被關(guān)閉，也可能不受反義RNA產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。反義技術(shù)在應(yīng)用上有著廣闊的前景。現(xiàn)已應(yīng)用于抗腫瘤，抗病毒的治療研究，對某些遺傳病甚至寄生蟲病的治療（如錐蟲?。┮部赡馨l(fā)揮作用。但農(nóng)業(yè)上除了培養(yǎng)抗病毒植株外，現(xiàn)已應(yīng)用于果蔬運輸?shù)谋ｕr以及珍奇花卉的培育。嚴(yán)緊反應(yīng)當(dāng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)它們自己生長在饑餓的條件下，缺乏維持蛋白質(zhì)合成的氨基酸時，它們將大部分活性區(qū)域都關(guān)閉掉。此就稱為嚴(yán)緊反應(yīng)(strigent response)，這是它們抵御不良條件，保存自己的一種機(jī)制。細(xì)菌通過僅僅維持最低量的活性來節(jié)約其資源，直到條件改善時，它們又恢復(fù)活動，所有代謝區(qū)域也都活躍起來。 嚴(yán)緊反應(yīng)導(dǎo)致rRNA和tRNA合成大量減少（1020倍），使RNA的總量下降到正常水平的510%，部分種類的mRNA的減少，導(dǎo)致mRNA總合成量減少約3倍。而蛋白質(zhì)除解的速度增加,很多代謝進(jìn)行調(diào)整，顯然核苷酸，碳水化合物，肽類等的合成都隨之減少。嚴(yán)緊反應(yīng)導(dǎo)致兩種特殊核苷酸積聚：(1)ppGpp—四磷酸鳥苷（在G的539。和339。位點各附著兩個磷酸）。(2) pppGpp—五磷酸鳥苷（鳥苷539。一三磷酸339。二磷酸）。人們最初發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在氨基酸饑餓時，出現(xiàn)兩種特殊的核苷酸，其電泳的遷移率和一般的核酸不同，感到很奇怪，就稱之為“魔斑Ⅰ”和“魔斑Ⅱ”，后來發(fā)現(xiàn)魔斑Ⅰ便是ppGpp，魔斑Ⅱ是pppGpp。這些鳥苷是典型的小分子效應(yīng)物，預(yù)期它們的功能是和靶蛋白結(jié)合改變它們的活性，有時它們被稱為（p）ppGpp。（p）ppGpp的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞活性大分子的協(xié)調(diào)性。它們的產(chǎn)物是由兩種途徑來控制的。在嚴(yán)峻的條件下嚴(yán)緊反應(yīng)可以觸發(fā)(p)ppGpp的增加。一些未知因素的調(diào)節(jié)也會出現(xiàn)（p）ppGpp水平與細(xì)菌生長速度之間的反向協(xié)調(diào)。任何一種氨基酸的缺乏或使任何氨基酰tRNA合成酶的失活突變都足以起始嚴(yán)緊反應(yīng)，此表明嚴(yán)緊反應(yīng)的觸發(fā)器是位于核糖體A位點中的空載tRNA。當(dāng)然在正常條件下僅有氨基酸t(yī)RNA在EETu的作用下位于A位點。但當(dāng)氨基酸t(yī)RNA對一個特殊的密碼子不能作出有效反應(yīng)時，空載tRNA便能得以進(jìn)入，當(dāng)然這就阻斷了核糖體的進(jìn)程，而觸發(fā)了一個空轉(zhuǎn)反應(yīng)（idiling reaction）。通過空轉(zhuǎn)反應(yīng)產(chǎn)生（p）ppGpp的有關(guān)成分已通過松馳型突變（relaxed(rel)mutants）被鑒別出來。rel突變能去除嚴(yán)緊反應(yīng)。這樣氨基酸的饑餓便不會導(dǎo)致合成任何穩(wěn)定的RNA或者通常見到的各種其它的反應(yīng)。松馳突變大部分基因位點位于relA基因中，此基因編碼一種蛋白，稱為嚴(yán)緊因子（stringent factor）。此因子和核糖體結(jié)合，雖然它的總量較低－每200核糖體低于1分子的嚴(yán)緊因子。因此似乎只有在核糖體少量存在時才能產(chǎn)生嚴(yán)緊反應(yīng)。 從嚴(yán)緊反應(yīng)中分離的核糖體在體外能合成ppGpp和pppGpp。A位點是通過一個空載tRNA對密碼子的特異反應(yīng)所提供的。從松馳突變體中提取的核糖體不能執(zhí)行嚴(yán)緊反應(yīng)，但若有嚴(yán)緊因子存在它們是能合成(p)ppGpp的。圖1658表示（p）ppGpp的合成途徑，嚴(yán)緊因子（RelA）是一種（p）ppGpp的合成酶，它可以催化ATP將焦磷酸加到另一個GTP或GDD的339。位點。當(dāng)條件恢復(fù)到正常時，ppGpp怎樣被去除的呢？有一個基因叫做spoT，它編碼一種酶，主要的作用是催化ppGpp的降解。這種酶的活性導(dǎo)致ppGpp迅速降解其半衰期為20秒左右，因此(p)ppGpp合成結(jié)束時，嚴(yán)緊反應(yīng)很快就消除。spoT突變會提高ppGpp的水平，并會慢慢增加。RelA酶用GTP作為底物的頻率是較高的，所以pppGpp的產(chǎn)生是占優(yōu)勢的。但pppGpp可以通過各種酶轉(zhuǎn)化為ppGpp，其中翻譯因子EFTu和EFG是可以去磷酸化的。通過pppGpp產(chǎn)生ppGpp是最通用的路線，而ppGpp通常就是嚴(yán)緊反應(yīng)的效應(yīng)物。圖1659表明核糖體對空載tRNA進(jìn)入的反應(yīng)與正常蛋白質(zhì)合成的比較。當(dāng)ETTu將氨基酸t(yī)RNA放在A位點時肽鏈隨著核糖的移動而合成；但是當(dāng)空載tRNA在A位點與密碼子配對時，核糖體仍保持不動，并進(jìn)行了空轉(zhuǎn)反應(yīng)。提純的RelA酶它本身實際是沒有活性的。而在核糖體存在時它才有活性。它的活性是由核糖體在合成蛋白中的狀態(tài)所控制的。此控制的特點是通過另一個位點的松馳突變而顯示，此突變原來稱為relC，現(xiàn)在弄清楚它就是編碼50S亞基L11蛋白的rp1K基因。此蛋白位于A位點和P位點的附近，它在此位置對合適的配對作出反應(yīng)，空載tRNA是在A位。L11蛋白或某些其它成分構(gòu)象的改變可能激活RelA酶，這樣空轉(zhuǎn)反應(yīng)就代替了肽酰tRNA的轉(zhuǎn)位。（p）ppGpp合成的每條途徑都觸發(fā)空載tRNA從A位點釋放出來，因此（p）ppGpp的合成是一種對空載tRNA水平的持續(xù)反應(yīng)。在饑餓條件下，當(dāng)氨基酰tRNA不能對A位點的密碼子作出有效反應(yīng)時，核糖體便停滯不前?？蛰dtRNA的進(jìn)入，觸發(fā)了(p)ppGpp分子的合成。并將空載tRNA排出，使A位重新空出來。核糖體是恢復(fù)多肽的合成，還是進(jìn)行另一輪的空轉(zhuǎn)反應(yīng),關(guān)鍵是取決于氨基酰tRNA是否有效。ppGpp有什么作用呢？它是一系列反應(yīng)的效應(yīng)物，包括抑制轉(zhuǎn)錄。許多反應(yīng)已被報導(dǎo)，其中2個較為突出：（1）rRNA操縱子的啟動子其轉(zhuǎn)錄起始被嚴(yán)緊反應(yīng)特異抑制了。嚴(yán)緊調(diào)節(jié)的啟動子發(fā)生突變能消除嚴(yán)緊控制，表明此效應(yīng)需要和特異啟動子順序相互作用；（2）很多或大部分模板的轉(zhuǎn)錄延伸階段被ppGpp縮短了，此是RNA聚合酶停頓的增加而引起的。此效應(yīng)反應(yīng)了在細(xì)胞內(nèi)加入ppGpp時轉(zhuǎn)錄效率普遍下降?，F(xiàn)在尚不清楚這種抑制的特異性，若不同的操縱子之間這種抑制的變化很大，某些操縱子抑制作用更為顯著的活，也是不足為奇的。異常核苷酸在兩種控制系統(tǒng)中都能發(fā)揮作用是很有趣的現(xiàn)象。這兩種途徑的抑制對細(xì)菌來說是特異的。在營養(yǎng)缺乏時烏苷觸發(fā)了嚴(yán)緊反應(yīng)。而在缺乏葡萄糖時，cAMP觸發(fā)碳源利用的轉(zhuǎn)換。圖1637表示（p）ppGpp的合成途徑，嚴(yán)緊因子（RelA）是一種（p）ppGpp的合成酶，它可以催化ATP將焦磷酸加到另一個GTP或GDP的3′位點。當(dāng)條件恢復(fù)到正常時，有一個基因叫做spoT，它編碼一種酶，主要的作用是催化ppGpp迅速降解，其半衰期為20秒左右。因此(p)ppGpp合成結(jié)束時，嚴(yán)緊反應(yīng)很快就消除。spoT突變會提高ppGpp的水平，并會慢慢增加?！? RelA酶用GTP作為底物的頻率是較高的，所以pppGpp的產(chǎn)生是占優(yōu)勢的。但pppGpp可以通過各種酶轉(zhuǎn)化為ppGpp。通過pppGpp產(chǎn)生ppGpp是最通用的路線，而ppGpp通常就是嚴(yán)緊反應(yīng)的效應(yīng)物?！? 圖1638表明核糖體對空載tRNA進(jìn)入的反應(yīng)與正常蛋白質(zhì)合成的比較。當(dāng)ETTu將氨基酸t(yī)RNA放在A位點時肽鏈隨著核糖的移動而合成；但是當(dāng)空載tRNA在A位點與密碼子配對時，核糖體仍保持不動，并進(jìn)行了空轉(zhuǎn)反應(yīng)。提純的RelA酶它本身實際是沒有活性的。而在核糖體存在時它才有活性。它的活性是由核糖體在合成蛋白中的狀態(tài)所控制的。此控制的特點是通過另一個位點的松弛突變而顯示，此突變原來稱為relC，現(xiàn)在弄清楚它就是編碼50S亞基L11蛋白的rp1K基因。此蛋白位于A位點和P位點的附近，它在此位置對合適的配對作出反應(yīng)，空載tRNA是在A位。L11蛋白或某些其他成分構(gòu)象的改變可能激活RelA酶，這樣空轉(zhuǎn)反應(yīng)就代替了肽酰tRNA的轉(zhuǎn)位。?。╬）ppGpp合成的每條途徑都觸發(fā)空載tRNA從A位點釋放出來，因此（p）ppGpp的合成是一種對空載tRNA水平的持續(xù)反應(yīng)。在饑餓條件下，當(dāng)氨基酰tRNA不能對A位點的密碼子作出有效反應(yīng)時，核糖體便停滯不前?？蛰dtRNA的進(jìn)入，觸發(fā)了(p)ppGpp分子的合成。并將空載tRNA排出，使A位重新空出來。核糖體是恢復(fù)多肽的合成，還是進(jìn)行另一輪的空轉(zhuǎn)反應(yīng),關(guān)鍵是取決于氨基酰tRNA是否有效?！? ppGpp有什么作用呢？它是一系列反應(yīng)的效應(yīng)物，包括抑制轉(zhuǎn)錄（圖1639）。許多反應(yīng)已被報導(dǎo)，其中2個較為突出：①rRNA操縱子的啟動子其轉(zhuǎn)錄起始被嚴(yán)緊反應(yīng)特異抑制了。嚴(yán)緊調(diào)節(jié)的啟動子發(fā)生突變能消除嚴(yán)緊控制，表明此效應(yīng)需要和特異啟動子序列相互作用；②很多或大部分模板的轉(zhuǎn)錄延伸階段被ppGpp縮短了，此是RNA聚合酶停頓的增加而引起的。此效應(yīng)反應(yīng)了在細(xì)胞內(nèi)加入ppGpp時轉(zhuǎn)錄效率普遍下降?，F(xiàn)在尚不清楚這種抑制的特異性，若不同的操縱子之間這種抑制的變化很大，某些操縱子抑制作用更為顯著的活，也是不足為奇的。異常核苷酸在兩種控制系統(tǒng)中都能發(fā)揮作用是很有趣的現(xiàn)象。這兩種途徑的抑制對細(xì)菌來說是特異的。在營養(yǎng)缺乏時烏苷觸發(fā)了嚴(yán)緊反應(yīng)。而在缺乏葡萄糖時，cAMP觸發(fā)碳源利用的轉(zhuǎn)換。ppGpp有什么作用呢？它是一系列反應(yīng)的效應(yīng)物，包括抑制轉(zhuǎn)錄（圖1639）。許多反應(yīng)已被報導(dǎo)，其中2個較為突出：①rRNA操縱子的啟動子其轉(zhuǎn)錄起始被嚴(yán)緊反應(yīng)特異抑制了。嚴(yán)緊調(diào)節(jié)的啟動子發(fā)生突變能消除嚴(yán)緊控制，表明此效應(yīng)需要和特異啟動子序列相互作用；②很多或大部分模板的轉(zhuǎn)錄延伸階段被ppGpp縮短了，此是RNA聚合酶停頓的增加而引起的。此效應(yīng)反應(yīng)了在細(xì)胞內(nèi)加入ppGpp時轉(zhuǎn)錄效率普遍下降?，F(xiàn)在尚不清楚這種抑制的特異性，若不同的操縱子之間這種抑制的變化很大，某些操縱子抑制作用更為顯著的活，也是不足為奇的?！? 異常核苷酸在兩種控制系統(tǒng)中都能發(fā)揮作用是很有趣的現(xiàn)象。這兩種途徑的抑制對細(xì)菌來說是特異的。在營養(yǎng)缺乏時烏苷觸發(fā)了嚴(yán)緊反應(yīng)。而在缺乏葡萄糖時，cAMP觸發(fā)碳源利用的轉(zhuǎn)換。mRNA穩(wěn)定性對翻譯的調(diào)控′—3′外切活性的核糖酸酶，降解mRNA有的酶有兩種：RNaseII和多核苷酸磷酸化酶，這兩種酶都是3′—5′的外切酶，但mRNA的二級結(jié)構(gòu)可以阻遏這些酶的作用。 ，發(fā)現(xiàn)一種高度保守的反向重復(fù)順序（IR），對mRNA的穩(wěn)定性起著重要的作用。~1000拷貝。它們有的位于3′端非編碼區(qū)，有的在基因間的間隔區(qū)。IR的存在提供了形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的可能性，從而增加mRNA上游部分的半衰期，對下游部分影響不大。這是由于IR的存在可以防止3′－5′外切酶的降解作用。因此在多順序反子的操縱子中，基因間的IR可以特異地使其某些基因上游mRNA得到保護(hù)。（圖1640）。malE和malF雖然同在一個操縱子中，而且緊密連鎖，但malE的產(chǎn)物(周質(zhì)結(jié)合蛋白)要比malE的產(chǎn)物(一種40KDa的內(nèi)膜蛋白)的含量高2040倍。這可能由于malG和malF的mRNA區(qū)域不如malE的區(qū)域穩(wěn)定，在malE 3′端有2個IR存在，可以形成莖環(huán)保護(hù)其不被外切酶所降解。若IR區(qū)缺失，那么malE產(chǎn)物的量就會減少到原來的1/9。27 / 27