【正文】 是證明在 突變株 中有 失活酶 的存在 。 主要實(shí)驗(yàn)方法有： 免疫血清反應(yīng) ★ 免疫血清反應(yīng) :一種酶的免疫血清能和該酶蛋白發(fā)生沉淀反應(yīng)使之失去酶活性 。 ★ 在缺陷型 突變株 中某一種酶的活性消失了 ， 可是 一級(jí)結(jié)構(gòu)略有改變的這種酶蛋白 ， 也會(huì)與該酶的免疫血清反應(yīng)而測(cè)得它的存在 。 ★ 這種失去酶活性但仍保存了免疫血清學(xué)特性的物質(zhì)稱為 交叉反應(yīng)物質(zhì) （ CRM） 。 ★ 證明失活酶存在的 實(shí)驗(yàn)過程： ① 試管滴定法： 用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清 在突變株酶抽提物中加入抗血清 反應(yīng)后離心去除沉淀物 在上清液中加入野生型代謝酶 若不產(chǎn)生或只有很少沉淀產(chǎn)生，說明突變株中有與酶蛋白結(jié)構(gòu)相似的CRM。 ?② 培養(yǎng)皿測(cè)定法 ： 野生酶 抗酶抗血清 2,3,4,5,6突變型抽提物 如果突變株抽提物中有 CRM存在，也會(huì)產(chǎn)生相同的沉淀帶 . 抗血清將在瓊脂中擴(kuò)散 ??? 在抗血清和酶接觸的地方形成肉眼可見的白色沉淀帶 ??? (一 )驗(yàn)證 “一個(gè)基因一種酶 ”假說 證明了結(jié)構(gòu)基因的作用 在研究中首先發(fā)現(xiàn) ： ? 同一營(yíng)養(yǎng)缺陷型是由幾個(gè)非等位基因突變產(chǎn)生的 ? 或者：引起相同突變的基因并不是等位的 該假說在研究 粗糙脈孢菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變中提出的 營(yíng)養(yǎng)缺陷與遺傳代謝性障礙的關(guān)系 這一現(xiàn)象通過 來解釋 1 營(yíng)養(yǎng)缺陷與遺傳代謝性障礙的關(guān)系 x??? A??? B??? C??? D 氨基酸 D營(yíng)養(yǎng)缺陷突變型 甲 乙 丙 丁 ★ 氨基酸 D由一系列的遺傳代謝產(chǎn)生的 ★ 任何一步 遺傳代謝性障礙會(huì)產(chǎn)生氨基酸 D營(yíng)養(yǎng)缺陷突變型 ★ 任何一步 遺傳代謝由基因控制，因此基因突變可導(dǎo)致遺傳代謝性障礙 ★ 在實(shí)驗(yàn)中 ,通過添加中間產(chǎn)物 ,突變株可以恢復(fù)正常生長(zhǎng) ? 同一營(yíng)養(yǎng)缺陷型是由幾個(gè)非等位基因突變產(chǎn)生的 營(yíng)養(yǎng)缺陷與遺傳代謝性障礙的關(guān)系 這一現(xiàn)象通過 被證實(shí) 互養(yǎng)現(xiàn)象 被證實(shí) 這一現(xiàn)象通過 2 互養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 不同氨基酸 D缺陷型可以通過互養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來區(qū)別 互養(yǎng)實(shí)驗(yàn)同樣可以證明基因的等位性 ① ② ③ 3 “一個(gè)基因一種酶 ” 假說的驗(yàn)證 ? 假說 :每一個(gè)基因控制一種酶的一級(jí)結(jié)構(gòu) ? 基因突變使酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，從而使酶的活性喪失。 ? 驗(yàn)證假說 :證明在突變株中有失活酶的存在 ? 驗(yàn)證方法 :免疫血清反應(yīng) ① 試管滴定法 ： 用野生型菌株的酶注射家兔，取得它的抗酶抗血清 在突變株酶抽提物中加入抗血清 反應(yīng)后離心去除沉淀物 在上清液中加入野生型代謝酶 若不產(chǎn)生或只有很少沉淀產(chǎn)生，說明突變株中有與酶蛋白結(jié)構(gòu)相似的 CRM。 基因突變導(dǎo)致酶失活 , 基因控制酶的一級(jí)結(jié)構(gòu) ?② 培養(yǎng)皿測(cè)定法 ： 野生酶 抗酶抗血清 2,3,4,5,6突變型抽提物 也證明了突變株里有失活酶的存在 第 二節(jié)、順反子和互補(bǔ)群 互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)和順反子 互補(bǔ)作用 ： 是使二個(gè)突變型的染色體同處于一個(gè)細(xì)胞內(nèi) ， 在不發(fā)生基因重組的條件下 ， 由于相應(yīng)突變型基因的相互補(bǔ)償而使細(xì)胞表型正常化的作用 。 互補(bǔ)作用在實(shí)質(zhì)上是兩個(gè)突變基因在同一細(xì)胞內(nèi)的互養(yǎng)作用 。 ? 互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)的基本要求： ? 不發(fā)生基因重組。 ? 凡是符合這一要求的二倍體、 異核體 ，或者是感染了兩個(gè)突變型噬菌體的寄主細(xì)菌都可以用作互補(bǔ)作用的測(cè)驗(yàn)系統(tǒng)。 1）異核體形成測(cè)驗(yàn) ? 將兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷或其它突變型的分生孢子 混合接種在基本培養(yǎng)基上 ，若能培養(yǎng)（基本培養(yǎng)基 )獲得異核體菌株）， 則表明供試突變型的兩個(gè)基因在功能上不相同，屬子非等位基因。 ?反之，如果不能形成異核體菌株，原因有兩個(gè)： ? 供試突變型的兩個(gè)基因 屬于等位基因，不能夠互補(bǔ)。 ?還可能來自于兩個(gè)突變株之間的不親和性，即兩個(gè)菌絲體之間不能經(jīng)質(zhì)配而形成異核體。 ? 例：已知某一真菌的精氨酸突變株A1和 A2不能在基本培養(yǎng)基上形成異核體 ? 經(jīng)過誘變從 A1中篩選獲得抗鏈霉素突變株 Smr A1，從 A2中篩選獲得抗卡那霉素突變株 Kmr A2 ? kmr 和 smr 為非等位基因 。 Smr A1孢子 Kmr A2孢子 Sm＋ Km＋ A平板 不能得到異核體 突變株 A1和 A2不親合 能得到異核體 在 Sm＋ Km＋ 平板上不能得到 異核體 A1和 A2是等位基因突變 ★ 異核體形成測(cè)驗(yàn) 和 互養(yǎng)測(cè)驗(yàn) 都是基因互補(bǔ)性測(cè)驗(yàn) 。 ? 其差異主要在于：互養(yǎng)測(cè)驗(yàn)時(shí)兩個(gè)突變株之間通過培養(yǎng)基相互提供自身不能合成的代謝產(chǎn)物 （ 分泌到細(xì)胞外 ） ， ? 異核體形成測(cè)驗(yàn)中兩個(gè)突變基因在同一細(xì)胞內(nèi)相互提供 基因轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物或酶 。 2）順反位置效應(yīng)測(cè)驗(yàn) ★ 比較結(jié)構(gòu)基因的順式和反式結(jié)構(gòu)表型效應(yīng)的互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)稱為順反位置效應(yīng)測(cè)驗(yàn) 。 ★ 基因位點(diǎn)：同一個(gè)基因的各個(gè)突變型結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的位置 。 ★ 一個(gè)基因座位內(nèi)可以有多個(gè)位點(diǎn) ， 在發(fā)揮作用上仍屬于統(tǒng)一的整體 ， 一個(gè)座位是一個(gè)功能單位 ， 稱它為順反子 （ cistron） 。 ★ 當(dāng)一個(gè)座位中的兩個(gè)突變位點(diǎn)排列在一條染色體上 ， 而兩個(gè)野生型位點(diǎn)排列在另一條同源染色體上相對(duì)位置上時(shí) ， 這種排列稱為順式 （ cis） , ★ 當(dāng)一個(gè)座位中的兩個(gè)突變位點(diǎn)分別排列在同源兩條染色體上時(shí) ， 這種排列稱為反式 （ trans） (圖 ) 順式 反式 ?順反位置效應(yīng)測(cè)驗(yàn) ★ 用大腸桿菌噬菌體 T4的快速溶菌突變株 （ r） 分別感染 B、 S和 K等三個(gè)不同的大腸桿菌菌株 ， 可以進(jìn)一步區(qū)分出 rI、 rII和 rⅢ 等三種類型（ 表 ） ★ 各種 rⅡ 突變型組合得到的野生型噬菌體數(shù)各不相同。 ★這說明這些突變位點(diǎn)之間的距離不同 。 重組實(shí)驗(yàn) 通過重組實(shí)驗(yàn)可以確定不同缺陷型基因相對(duì)位置 重組類型 rⅡ A+/rⅡ B+為野生型 , 可在 K上形成噬菌斑， 重組類型 rⅡ A/rⅡ B為缺陷型 ,不能可在 K上形成噬菌斑。 ★ r47， r106和 r51等表型效應(yīng)相同的位點(diǎn)是屬于同一個(gè)基因 ， 還是不同的基因 ？可以通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明 。 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定不同突變位點(diǎn) 是否屬于同一個(gè)基因 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) ★ 將一系列 rⅡ rⅡ rⅡ rⅡ 4兩兩配對(duì) ， 計(jì)算兩位點(diǎn)重組頻率 , 確定相對(duì)位置 . ★ 把所有的 rⅡ 突變型兩兩互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)，得到 A和 B兩大群 ★ 由此可見 ， 在兩個(gè) rⅡ 突變型混合感染時(shí)出現(xiàn)的突變型噬菌斑 ， 是由于兩個(gè) rⅡ 突變型具有互補(bǔ)作用； ★ 它們相互滿足在寄主 K中進(jìn)行復(fù)制所需要的因素 ， 從而恢復(fù)了復(fù)制能力； ★ 在復(fù)制過程中發(fā)生了基因重組 ,并產(chǎn)生野生型噬菌體 。 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定不同突變位點(diǎn) 是否屬于同一個(gè)基因 3）雜基因子： 細(xì)胞中如某一野生型基因和突變型基因共存 , 即個(gè)別基因呈雜合狀態(tài)的細(xì)胞稱為雜基因子。 ? ★ 例 。利用 λ噬菌體的 λdg和 λdb轉(zhuǎn)導(dǎo)子感染相應(yīng)的缺陷型宿主細(xì)胞，很容易獲得 雜基因子 。 ★ 將 Gal Gal 和 Gal4等三個(gè)半乳糖發(fā)酵缺陷型突變株作為受體菌先劃線接種在半乳糖培養(yǎng)基上 。 ★ 分別滴加從 Gal+、 Gal Gal 2和Gal 4獲得的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體 λdg。 ★ 經(jīng)培養(yǎng)后可以發(fā)現(xiàn)：如果 供體菌和受體菌突變基因不同 ， 那么均可出現(xiàn)紅色的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 。 ★ 在 Gal1和 Gal4之間只產(chǎn)生少量延遲出現(xiàn)的紅色小菌落 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（ EMB） 該培養(yǎng)基中添加 半乳糖 為碳源 ,如果大腸桿菌為半乳糖發(fā)酵缺陷型 ,則不能生長(zhǎng) ,如果能夠發(fā)酵利用半乳糖 ,產(chǎn)酸產(chǎn)氣 , pH變化引起 伊紅美蘭顏色變化 ,形成紅色大菌落 . Gal Gal 和Gal4為半乳糖發(fā)酵缺陷型突變株 整片紅色菌落是雜基因子后互補(bǔ)的結(jié)果； 延遲出現(xiàn)的少數(shù)紅色菌落發(fā)生基因重組的結(jié)果。 ★ 首先出現(xiàn)的 整片紅色菌落 是供 、 受體菌基因形成 雜基因子后互補(bǔ) 的結(jié)果； ★ 延遲出現(xiàn)的少數(shù)紅色菌落 是由于雜基因子在繁殖過程中發(fā)生 基因重組 的結(jié)果 。 ? ? 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確定 Gal Gal2和 Gal Gal4屬于不同的順反子 互補(bǔ)作用 ?Gal1和 Gal4屬于同一順反子 重組作用 。 Smr A1孢子 Kmr A2孢子 Sm＋ Km＋ A平板 不能得到異核體 突變株 A1和 A2不親合 能得到異核體 在 Sm＋ Km＋ 平板上不能得到 異核體 A1和 A2是等位基因突變 ① ② kmr 和 smr 為非等位基因。 順式結(jié)構(gòu) 反式結(jié)構(gòu) 2. 基因順反位置效應(yīng)測(cè)驗(yàn) 研究基因在四種相對(duì)位置下的重組和互補(bǔ)作用 (1)重組實(shí)驗(yàn) 確定不同突變基因相對(duì)位置 (2)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 確定不同突變位點(diǎn)是否屬于等位基因 既有互補(bǔ)作用又有重組作用 ：證明了基因互補(bǔ)作用 Gal Gal 和Gal4為半乳糖發(fā)酵缺陷型突變株 整片紅色菌落是雜基因子后互補(bǔ)的結(jié)果； 延遲出現(xiàn)的少數(shù)紅色菌落發(fā)生基因重組的結(jié)果。 某基因的野生型和突變型共存與同一細(xì)胞 雜基因子 野生型和突變型可以互補(bǔ)