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2025-01-06 11:56本頁面
【正文】 26 EHEC O104:H4檢測程序 1. 根據(jù)標(biāo)本的種類，按照公布標(biāo)準(zhǔn)的方法，進(jìn)行標(biāo)本的預(yù)處理。 2. 使用 EHEC增菌液增菌 6小時(shí)。 3. 對增菌液提取核酸，進(jìn)行 PCR檢測，包括毒力基因（ stxstx2）。 或可使用 DuPont PCR Reagent Kit (D14128299)直接加入增菌液進(jìn)行熒光定量 PCR檢測。 4. 對 PCR檢測 stx1, stx2 基因陽性的標(biāo)本，進(jìn)行 eae、 ehx、 aatA、aggR、 aap毒力基因和 O104和 H4的抗原特異性基因檢測。同時(shí)進(jìn)行大腸桿菌的分離培養(yǎng)鑒定，對單個(gè)菌落進(jìn)行生化、血清型鑒定。 27 EHEC O104:H4檢測程序 28 EHEC O104:H4毒力基因檢測 stx1 slt1a CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG 348bp slt1b CACCAGACAATGTAACCGCTG 針對 Shiga toxin 1 subunit A stx2 slt2a ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG 589bp slt2b GCGTCATCGTATACACAGGAGC 針對 Shiga toxin 2 subunit A 29 EHEC O104:H4毒力基因檢測 eaeA eaeAa ATTACCATCCACACAGACGGT 397bp eaeAb ACAGCGTGGTTGGATCAACCT ehxA MFS1F ACGATGTGGTTTATTCTGGA 167bp/369bp MFS1R CTTCACGTCACCATACATAT MFS1Fb CCAGGAGAAGAAGTTAGAG 30 EHEC O104:H4毒力基因檢測 aatA aatAF: 5’ tgaaatgcttagtgagag3’ 510bp aatAR: 5’gatacccagactagcact3’ aggR aggRF： 5’GTATGAAATTAAAACAA ACATCG3’ 800bp aggRR: 5’GTTTATTGGCTTTTAAAATAG TC3’ aap aapF： 5’ATGAAAAAAATTAA GTTTGTTATCTT3’ 356bp aapR： 5’TTATTTAACCCATTCG GTTAGAGC3’ 31 EHEC O104:H4毒力基因檢測 wzy1 agttcattagatcgaggtt 450bp wzy2 ctccttgcaaatgtgcaa O104檢測 PCR引物 32 EHEC O104:H4毒力基因檢測 H4檢測 PCR引物 H4特異 引物： fliC5 (539。TGA GTG ACC AGA CGA TAA CAG GG339。) fliC6 (539。GGA CGA TTA GTG GGT GAA ATG AGG339。) PCR產(chǎn)物大小 1243bp. 33 EHEC O104:H4毒力基因檢測（杜邦試劑盒） 熒光定量 PCR反應(yīng)體系： ? 將 Forward Primer和 Reverse Primer混合后用試劑盒提供的 PCR buffer稀釋至終濃度 ，取 25ul ? 取 PCR buffer裂解后的增菌液 25uL ? 總反應(yīng)體系 50uL，直接加入帶有 PCR藥片的反應(yīng)管中。 3
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