淋巴細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)-資料下載頁(yè)
2024-12-08 10:43本頁(yè)面
【正文】 計(jì)，也可以用 ELISPOT方法測(cè)定產(chǎn)生抗體的 B細(xì)胞數(shù)量估計(jì)。 ? B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生能力的測(cè)定 技術(shù)方法與評(píng)價(jià) 1. 分離 PBMC96孔板中每孔加入 1x105細(xì)胞和 PWM終濃度（ 1： 100）。陰性對(duì)照孔內(nèi)不加 PWM。每一實(shí)驗(yàn)設(shè) 2 復(fù)本。 2. 37C176。 5％ CO2培養(yǎng) 10天（ ELISA）或 7天（ ELISPOT）。 3. 收集上清，用 ELISA法測(cè)抗體。收集細(xì)胞，用ELISPOT法測(cè)產(chǎn)生抗體的 B細(xì)胞。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生能力的測(cè)定 應(yīng)用實(shí)踐 1. 用于確定 B細(xì)胞活化和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以及細(xì)胞因子和其它銀子對(duì) B細(xì)胞分化的影響。 2. 因?yàn)?B2細(xì)胞產(chǎn)生抗原需要 T細(xì)胞輔助，所以又可以用于檢測(cè) T細(xì)胞的輔助功能。 3. 臨床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者 B細(xì)胞分化異常的機(jī)制。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 絲裂原誘導(dǎo)多克隆抗體產(chǎn)生能力的測(cè)定 注意點(diǎn) 采用以抗體為基礎(chǔ)的技術(shù)（如磁珠法、淘洗法和流式細(xì)胞儀）分離的 B細(xì)胞，需考慮抗體對(duì) B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的影響（促進(jìn)或抑制作用）。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 ELISPOT法 基礎(chǔ)理論 ELISPOT全稱(chēng)為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ enzyme－ linked immunospot assay），可用于測(cè)定產(chǎn)生 IgG和 IgM抗體的 B細(xì)胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特異性 B細(xì)胞。如果 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抗體與板上的抗原結(jié)合。加入酶標(biāo)二抗和顯色劑就會(huì)顯色。一個(gè)斑點(diǎn)就代表一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 ELISPOT法 技術(shù)方法 1. 抗原包被： 37C176。 2h，或 4C176。 過(guò)夜。固相載體可用聚苯乙烯平皿、亞硝酸纖維膜、 96孔板。 2. 抗體生成細(xì)胞培育：加入適量抗體生成細(xì)胞，37C176。 ， 5％ CO2， 3～ 4h，或過(guò)夜。洗滌，去除為與固相結(jié)合的細(xì)胞。 3. 測(cè)定斑點(diǎn)產(chǎn)生細(xì)胞：加二抗， 37C176。 ， 5％ CO2，2～ 3h。加辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶和底物顯色。 4 計(jì)數(shù)： 24h后用 10～ 30倍顯微鏡下計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 ELISPOT法 評(píng)價(jià) 1. 在操作中應(yīng)使用無(wú)關(guān)抗原作陰性對(duì)照；并應(yīng)排除細(xì)胞標(biāo)本終抗體污染。 2. 硝酸纖維素膜靈敏度高于聚苯乙烯。 3. 與 ELISA聯(lián)合使用，可以估計(jì)單個(gè)細(xì)胞的抗體產(chǎn)量。 4 當(dāng)淋巴細(xì)胞受到嚴(yán)重污染時(shí)，也可以使用本法，所以適用于測(cè)定組織中抗體生成細(xì)胞。 應(yīng)用實(shí)踐 用途同 ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 ELISPOT比 ELISA靈敏度高 102～ 103倍 ELISPOT不僅能分析細(xì)胞因子分泌的總量變化，更能獨(dú)特檢測(cè)活化淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化。 ELISPOT可精確到檢測(cè)出一百萬(wàn)個(gè)淋巴細(xì)胞中的一個(gè)活化細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌 ELISA測(cè)定各類(lèi)免疫球蛋白 基礎(chǔ)理論 B細(xì)胞受抗原刺激后，最初產(chǎn)生 IgM抗體，然后在 Th細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子的作用下，可轉(zhuǎn)類(lèi)成為 IgG、 IgA、 IgE類(lèi)抗體。應(yīng)用不同的單抗，結(jié)合 ELISA方法，可以測(cè)定 B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的類(lèi)別。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 ELISA測(cè)定各類(lèi)免疫球蛋白 方法 1. 包板： 96孔板用濃度為 10181。g/ml的特異性單抗包被。蓋上蓋板， 37C176。 ， 5％ CO2， 2h，或 4C176。 過(guò)夜。常規(guī)洗板，封閉。 2. 上樣：每孔內(nèi)加入 1:10或 1:20 稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100181。l 。陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照為培養(yǎng)液。每試驗(yàn)設(shè) 2復(fù)本。室溫培育 2h，或 4C176。 過(guò)夜。 3. 加酶標(biāo)二抗：每孔加 100181。l 堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人 IgM或IgG或 IgA二抗。室溫培育 2h，或 4C176。 過(guò)夜。 4. 顯色：洗板，每孔加 100181。l 底物（ p－ nitrophenyl phosphate）。 5. 自動(dòng)酶標(biāo)儀讀數(shù)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出抗體濃度。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 ELISA測(cè)定各類(lèi)免疫球蛋白 評(píng)價(jià) ELISA法靈敏、簡(jiǎn)單、快速、特異性高、重復(fù)性好，是測(cè)定上清和體液中 Ig的首選方法。堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗顯色明顯，不必用堿中止反應(yīng)，尤其適用于測(cè)定體外產(chǎn)生的抗體。 應(yīng)用實(shí)踐 ELISA可測(cè)定各種體液中的抗體，其結(jié)果反映被檢個(gè)體 B細(xì)胞功能。測(cè)定免疫球蛋白各種亞類(lèi)的水平有助于鑒定免疫缺陷病。 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的測(cè)定 (二 )抗體形成細(xì)胞測(cè)定 反向溶血空斑形成實(shí)驗(yàn)（ reversed hemolytic plaque assay， RHPA ） 待檢人的 PBMC或組織來(lái)源的淋巴細(xì)胞（如扁桃體、脾細(xì)胞等） 待檢人的 PBMC或組織來(lái)源的淋巴細(xì)胞（如扁桃體、脾細(xì)胞等） SPA致敏的羊紅細(xì)胞（ SPASRBC） 抗人 Ig抗體 補(bǔ)體
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