【導讀】脊髓缺血－再灌注損傷模型建立：通過阻斷大鼠腹主動脈造成脊髓腰尾段缺血。應(yīng)用激光多譜勒血流儀，分別連續(xù)測。定腰髓血流變化。6h、9h、12h局部脊髓組織進行組織病理和透射電鏡檢查。局部血灌流量迅速下降至基線值的%(P值=)。增高并超過基線水平。證實了缺血再灌流。而再灌后，在恢復血供條件下，其病理改變加重，揭示了脊髓存在再灌注損傷。而延遲性低灌流現(xiàn)象主要與血脊髓屏障損害相關(guān)。脊髓損傷較缺血期明顯，表明再灌流后脊髓發(fā)生了二次損傷。動物實驗表明，正常脊髓微血管內(nèi)皮細胞表面僅有微量的ICAM-1表。面粘附分子ICAM-1mRNA的表達,并伴有相應(yīng)活性多肽及蛋白的合成分泌。內(nèi)皮ICAM-1及其調(diào)節(jié)因子IL-1β的表達增加是導致血脊髓屏障損害的重要分子基礎(chǔ)。其結(jié)果為缺血再灌注后可引起細胞乳酸。傷,并且有抗ICAM-1過量表達保護脊髓的作用。是防止損傷使其存活的必要措施。性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡。引起這些病理改變的原因目前仍不十分清楚。

　　

【正文】 D10000U/kg；Ⅲ組 13 人，再灌流前幾分鐘使rhSOD10000U/kg 進入心肺循環(huán)；Ⅳ組，用與Ⅲ組相同的辦法加入 rhSOD3000U/kg，每30min 接受一次血液和 GIK 溶液的持續(xù)再灌流。再灌流后 24h 內(nèi)在不同時間取動脈血樣，測定磷酸肌酸 MB 同工酶 (CPKMB)、α－羥基乳酸脫氧酶 (HBDH)、磷代巴比妥酸(TBA)的變化。第Ⅱ組再灌流后 12h 和 24h 的 CPKMB 值以及 12h 的 HBDH 值均比第 Ⅰ組低得多。第Ⅲ組的 CPKMB、 HBDH 值則與第Ⅳ組沒有明顯的差別。第Ⅱ組在 9h、 12h 的 TBA 值均比第Ⅰ組低。第Ⅰ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組的 TBA 水平?jīng)]有明顯的變化。這些結(jié)果表明，開心手術(shù)中， 再灌流時加入 rhSOD 可起到防止再灌流損傷的作用。Land[171]等在腎移植手術(shù)中，為確定 rhSOD 的效果，進行了有安慰劑對照組的隨機雙盲試驗。在試驗中，一部分手術(shù)者由靜 脈注入 200mg rhSOD。結(jié)果表明 rhSOD 在急性和周期性的排異反應(yīng)中起了有利的作用。首次急性排異反發(fā)生率從對照組 %控制為 %；早期不可逆的急性排異反應(yīng)發(fā)生率從 %控制為 %；從長期的結(jié)果來看， 4 年后移植物的存活率從對照組的 52%上升為 rhSOD 處理組的 74% ，并且預(yù)計半活期也可由 5 年延長至 15 年。 rhSOD 發(fā)揮作用的原因是在腎移植的局部缺血－再灌流引起損傷的過程中， 起到了抗氧化劑的作用，從而有效地降低移植物的免疫遺傳性，并在周期性消除排異性動脈硬化過程中起 有效的作用。 Schneeberger[172]等也得到了類似的結(jié)果，只是在數(shù)值上略有差異，由這些試驗可知急性排事件的發(fā)生并不是影響移植長期存活的危險因素，只有急性排異反應(yīng)與再灌流造成的損傷共同作用才是在長期的預(yù)測過程中起決定作用因素。主要的原因是 rhSOD 減輕了局部缺血－再灌流產(chǎn)生的自由基對移植的雙方產(chǎn)生損傷程序。具體地說，就是 rhSOD 減少了主要組織相容性復合體 (major histopatibility plex,MHC)、細胞發(fā)育粘連物分子的表達并且減輕了由 再灌流損傷引起 的抗原呈遞細胞 ( antigen presenting )活化的程度。 重組人超氧化物歧化酶的研制 生理狀態(tài)下 ,ECSOD 是組織中含量最少的 SOD 同功酶 ,因此 ,從動物組織或體液等天然材料中提純 ECSOD 難以滿足大量的研究及臨床需要 ,因此有必要開展重組人 ECSOD的研究。迄今為止 ,有關(guān)報道很少 , 目前還未見用原核細胞表達產(chǎn)生重組人 ECSOD 的報道。 Marklund 小組通過篩選人胎盤 CDNA 文庫 ,釣取 ECSOD 的 cDNA,在中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)和小鼠乳腺細胞中得到成功表達。吉林大學生命科學院酶工程實驗室開展了重組人 ECSOD 治療研究。 ECSODcDNA 在 CHO 細胞中的表達 :含 ECSODcDNA 的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO 細胞被轉(zhuǎn)染細胞分泌人 ECSOD 到培養(yǎng)基中。重組 ECSOD 性質(zhì)與人臍帶中分離出的天然酶相比 ,專一活性和氨基酸順序相同 ,氨基酸組成與從 cDNA 順序推導一致 , 產(chǎn)生的 ECSOD 是 C 型 ,因為它對肝素 Sepharose 親合力與天然 EC 型相同。重組、天然 ECSOD都與伴刀豆球蛋白 A篦麻凝集素、麥芽凝集素 結(jié)合 ,表明其為糖蛋白。 ECSOD 在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達 : 用鼠血清酸蛋白基因或牛β 乳球蛋白基因的調(diào)控元件來控制人 ECSOD 的表達。乳清酸蛋白調(diào)控順序指導重組基因在乳腺細胞中高水平地特異性表達 。以及生物活性 ECSOD,ECSOD 分泌入乳汁中產(chǎn)生的重組蛋白具有完全活性 ,是四聚體形式 ,表現(xiàn)肝素親合力 ,分子量類似于天然酶。另外 ,在兔模型中體內(nèi)血漿交換與以前研究的天然和 CHO 重組酶形式相似。這是四聚體、蛋白酶敏感的金屬蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因動物乳汁中有效表達的第一個例子。 天然人 ECSOD 的制備極 為有限 ,用基因工程方法大量生產(chǎn) ECSOD,可廣泛用于其在體內(nèi)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄方面的研究 , 并達到治療目的。 再灌注損傷微血管內(nèi)皮細胞粘附分子 ICAM1 及其調(diào)節(jié)因子 IL1β表達研究 前言 脊髓損傷 (spinal cord injury 簡稱 SCI)一直是困擾醫(yī)學界的一大難題。臨床研究中常見到 SCI 在解剖上并非完全橫斷 ,傷情并不嚴重 ,減壓后癥狀有所緩解，但以后發(fā)展為 “二次癱瘓 ”。臨床上對于 SCI 治療常見于針對缺 血恢復血供 ,而忽視了脊髓再灌注損傷?，F(xiàn)已證明 ,SCI 后血脊髓 屏障損害是導致組織繼發(fā)性、中心性、變性壞死的重要病理基礎(chǔ)。近二年許多研究表明 [163]， SCI 后動物雙后肢出 現(xiàn)二次癱瘓與脊髓組織延遲性低灌流密切相關(guān) , 脊髓微循環(huán)障礙在二次損傷中起著重要作用 , 因而提出了脊髓存在著缺血再灌注損傷 (spinal cord ischemia reperfusion injury I/R),然而 ,由脊髓再灌注引發(fā)的病理生理、生化因子參與的脊髓組織進行性、自毀破壞程度遠較缺血損傷嚴重。因此，有必要從分 子水平探討其發(fā)病機制，以期從致病環(huán)節(jié)阻斷及干預(yù)其發(fā)病進展，降低可逆性脊髓缺血性神經(jīng)系統(tǒng)的損害。脊髓缺血再灌注傷病因復雜，涉及了多種素目前認為，組織損傷可刺激介導中性粒細胞與血管內(nèi)皮間的粘附作用，這種用增強系由于兩細胞表面多種粘附分子的表達，其中內(nèi)皮細胞白細胞粘附分子 1(ELAM1)和細胞間粘附分子 1(ICAM1)及中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附過程中起關(guān)鍵的作 用。 ICAM1 是表達在血管內(nèi)皮細胞表面的單鏈糖蛋白 , 分子量 90KD,屬免疫球蛋白超家族粘附分子。其細胞外有五 個 Ig 樣位點能與白細胞表面粘附分子β 2 整合素受體結(jié)合 , 可使 PMN 緊密地粘附到血管壁 ,為隨后的活化、趨化及浸潤到周圍組織發(fā)揮細胞毒作用提供條件。正常時血管內(nèi)皮細胞連續(xù)微量表達 ICAM1,但是表達量的增加 .說明 ICAM1介導 PMN 與內(nèi)皮細胞的粘附及游出血管的過程 ,是內(nèi)皮細胞表達的諸多粘附分子中較為重要的一種。目前有關(guān)脊髓缺血再灌注損傷后微血管內(nèi)皮細胞表達 ICAM1 的機制仍不十分清楚 .國內(nèi)外尚無相關(guān)報告。有關(guān)研究多為體外實驗 [110117]，認為炎性介質(zhì) IL1β、 TNFα、 IFNγ等可誘導 ICAM1 表達。其中， IL1β是多功能的細胞因子 ,分子量, 在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育對各種損傷的反應(yīng)中有重要的作用。為早期答細胞因子 ,IL1β可被星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞和內(nèi)皮細胞合成分泌，在炎癥初期，通過發(fā)揮其多種生物學效應(yīng)如刺激它細胞因子和可溶性損傷介質(zhì)的合成、誘導 PMN 浸潤、影響膠質(zhì)細胞的基因表達等影響損傷的發(fā)展并調(diào)節(jié)創(chuàng)傷的愈合。 目前，國外雖有數(shù)篇文章分別探討了細胞因子和粘附分子在 I/R 時的表達 [110119], 但國內(nèi)外均未涉及到內(nèi)源性細胞因子和微血管皮 胞表面粘附分子在損傷后相關(guān)性的研究 ,對內(nèi)源性 IL1 在損傷中的表達也僅限于 mRNA 水平。故本實驗以大鼠急性脊髓I/R 損傷為模型，對 ICAM1 和內(nèi)源性 IL1β在脊髓 I/R 損傷時的表達進行定性和定量的動態(tài)觀察 ,了解它們在 I/R 損傷不同階段的變化規(guī)律和病理生理意義。旨在探討脊髓I/R 損傷對血脊髓屏障損害的分子機制，為臨床阻遏脊髓繼發(fā)性損害提供科學實驗依據(jù)。 實驗材料與方法 材料 實驗動物：雄性 Wistar 大鼠由白求恩醫(yī)大實驗動物中心提供 主要化學試劑和酶 十二烷基肌氨酸鈉 (Sarcosy1) SIGMA公司 , 美國 對硝基酚 β 纖維二糖苷 (pNPC) SIGMA公司 ,美國 焦碳酸二乙酯 (DRPC) SIGMA 公司 ,美國 RNasim、 Agorose、 dNTPs(dATP,dGTP, dCTP, dTTP)華美公司 。 異硫氫酸胍 PROMEGA公司 ,美國 AMV反轉(zhuǎn)錄酶 PROMEGA公司 ,美國 TaqDNA聚合酶 PROMEGA公司 ,美國 B巰基乙醇 (BME)、 Tris SANGON 公司 ,加拿大 抗大鼠 ICAM1 單克隆抗體 Ig GISEROTEC 公司 ,英國 免疫組化染色 SPTM 試劑盒 ZYMED 公司 ,美國 EITC 標 記的羊抗小鼠 IgG JACKSON 公司 ,美國 RTPCR 試劑盒 PROMEGA公司 ,美國 HISTOPAQUE1077 SIGMA 公司 ,美國 磷酸鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物 SIGMA公司 ,美國 HTAB STGMA 公司 ,美國 M199 培養(yǎng)基 GIBCO 公司 ,美國 液體配制 PBS 緩沖液 (1000ml) NaCl 8g KCL Na2HPO4H2O KH24 變性溶液 (100ml) 異硫氫酸胍 50g %DEPC 水 檸檬酸鈉 10%十二烷基肌氨 酸鈉 一巰基乙醇 培養(yǎng)液 M199 滅活的胎牛血清 20% 谷氨酰胺 2mM Hepes 20mM 肝素鈉 100u/ml 青霉素、鏈霉素 100u/ml ECGS 主要儀器 PEKIN ALMER 2400 PCR 擴增儀 美國 SIGMA ZK15 型 低溫高速臺式離心機 德國 PHARMACIA DNA/RNA 測定儀 美國 HITACHI U3400 分光光度計 日本 Bechman 71PH 計 美國 熒光生物顯微鏡 OLYMPUSBAS, 日本 倒置顯微鏡 OLYMPUSCK2, 日本 多普勒血流圖像儀 瑞典 二氧化碳培養(yǎng)箱 TEHER, 日本 低溫高速離心機 日立 SCR20BA, 日本 低溫超速離心機 日立 70P72, 日本 Soniprep 150 超聲粉碎儀 英國 Blo+尼龍膜 AMRESCO 公司 X光片和 X光片盒 天津感光材料公司 激光掃描共聚焦顯微鏡 美國 超低溫冰箱 SANYOMDF380, 日本 恒溫冷凍切片機 LAUDA, 德國 石蠟切片機 上海儀表廠 YL3 型 JEM1200EX 透射電鏡 日本 2197 Multiphor Ⅱ 電泳儀 瑞典 DYYⅡ 31A型水平瓊脂電泳槽 北京 紫外線透射儀 北京 PCR 引物 :由中國科學院微生物所合成