【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 膠圖象采集及分析斑點(diǎn)測(cè)量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標(biāo)注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。(1)打開(kāi)電腦，啟動(dòng)凝膠分析軟件，進(jìn)入用戶(hù)界面。（2）打開(kāi)采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開(kāi)關(guān)，放入凝膠，打開(kāi)紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰?？芍苯訉D像保存起來(lái)，也可通過(guò)“圖像處理”對(duì)圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對(duì)比度??方面的處理。(3)對(duì)讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個(gè)紅色的矩形框。還可進(jìn)入“條帶分析”系統(tǒng)，對(duì)條帶 lid temp：℃”enter”鍵進(jìn)入，用四個(gè)移位鍵移動(dòng)設(shè)定位置。先設(shè)定溫度，后設(shè)定時(shí)pgm ok”鍵，所設(shè)定的程序自動(dòng)被保存。按“Stop”可停止運(yùn)行。markers比較后，可精確計(jì)算樣本的分子量，對(duì)核酸電泳也可準(zhǔn) “開(kāi)始采集”105℃。待蓋子預(yù)熱后按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開(kāi)始運(yùn)行。顯示 agarose本系統(tǒng)包括暗箱，.軟件（）。該軟件提供對(duì)電泳凝膠、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清 710℃，例如變enter”鍵，進(jìn)入下一 紫外透射儀，攝 進(jìn)行編號(hào)，對(duì)“，蓋子的溫度一般比變性溫度要高 電泳膠片，及蛋白質(zhì)的二條以上的條帶進(jìn)行比較。（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開(kāi)關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。八、空氣恒溫?fù)u床搖床（振蕩器）為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備。SHK99Ⅱ型臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度177?！妫粫r(shí)間范圍：1分鐘～99小時(shí)59分鐘；轉(zhuǎn)速范圍：60RPM～250RPM。(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：000屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時(shí)間，不設(shè)定時(shí)可自動(dòng)累計(jì)時(shí)間一直運(yùn)行。的值隨時(shí)可以修改，隨時(shí)按新值運(yùn)行。(2）工作程序設(shè)置。按“F1”鍵，進(jìn)入設(shè)置狀態(tài)?？稍谒俣?，溫度，時(shí)間，運(yùn)行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個(gè)位數(shù)據(jù)，按“鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“(3）再按“F1”鍵，轉(zhuǎn)回運(yùn)行狀態(tài)，按“(4）按“End”鍵，結(jié)束系統(tǒng)運(yùn)行。（1）打開(kāi)電源，系統(tǒng)開(kāi)始自檢，等待完畢，可以進(jìn)行第2步參數(shù)設(shè)置。若屏幕出現(xiàn)：錯(cuò)誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機(jī)部分有錯(cuò)誤。（2）運(yùn)行過(guò)程可以打開(kāi)箱蓋，這樣電機(jī)不運(yùn)行，時(shí)間也停止，蓋上蓋接著運(yùn)行。（3）工作完畢，關(guān)閉電源。關(guān)機(jī)后，要等一段時(shí)間再開(kāi)機(jī)。九、水的凈化裝置分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)水的純度要求越來(lái)越高，RPMTempTime00:00 2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘“Temp”、“RPM”、F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。Start”鍵，電機(jī)開(kāi)始運(yùn)行，時(shí)間開(kāi)始計(jì)時(shí)。LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測(cè)線路有一般蒸餾水常常難以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，大多要求要Time”F2”“ 進(jìn)行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機(jī)雜質(zhì)，但制作時(shí)間較長(zhǎng)，而且無(wú)機(jī)雜質(zhì)還是很多。許多實(shí)驗(yàn)還需要去離子水，這就需要陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行處理。目前，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國(guó)微孔濾膜公司的MilliQ超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測(cè)序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。下面介紹ROMB壁掛式反滲透高純水機(jī)性能及使用方法。ROMB反滲透高純水機(jī)（杭州永潔達(dá)）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：；可用自來(lái)水制成普通實(shí)驗(yàn)用水和高純水，同時(shí)滿(mǎn)足不同水質(zhì)要求。在線電導(dǎo)率儀對(duì)產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測(cè)，可保證產(chǎn)水質(zhì)量。(1)準(zhǔn)備：先檢測(cè)與純水機(jī)相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開(kāi)原水閥門(mén)。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）220V電源插座上。(2）開(kāi)機(jī)：依次按下電源開(kāi)關(guān)，泵開(kāi)關(guān)，純水機(jī)啟動(dòng)產(chǎn)水，同時(shí)廢水排出，指示燈亮起，并處于自動(dòng)運(yùn)行狀態(tài)。(3）取純水：若打開(kāi)閥門(mén)打開(kāi)時(shí)，檢測(cè)儀表顯示高純水電導(dǎo)率或電阻值。一杯水后再取新鮮水。(4）關(guān)機(jī)：不用時(shí)可關(guān)閉個(gè)按鈕停機(jī)，自來(lái)水進(jìn)水閥門(mén)不必關(guān)閉，這時(shí)機(jī)子內(nèi)部的進(jìn)水電磁閥已自動(dòng)切斷水路。只要管路閥門(mén)不漏，也可使機(jī)子保持自動(dòng)待機(jī)狀態(tài)。（1）純水機(jī)的正常使用環(huán)境溫度為度不低于5℃。（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個(gè)月更換一次，實(shí)際使用壽命與自來(lái)水水質(zhì)、總過(guò)濾量等有關(guān)。（3）混床濾芯產(chǎn)高純水約水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。天開(kāi)機(jī)30分鐘沖洗一次，冬季每隔（4）使用過(guò)程若發(fā)現(xiàn)停機(jī)后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，此為管路漏水引起，需及時(shí)打開(kāi)機(jī)箱加以解決。象，有利于沖洗和保護(hù)反滲透膜元件，十、消毒設(shè)備細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實(shí)驗(yàn)所用的試劑、RO純水或高純水出口閥門(mén)，則可獲得相應(yīng)水質(zhì)的純水。當(dāng)高純水出口 115～3噸，約二至四個(gè)月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。將電源插頭插入帶有接地線的為了獲得高質(zhì)量的高純水，可以先放掉 35℃，產(chǎn)水量會(huì)隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫實(shí)際使用壽命與自來(lái)水水質(zhì)、2天。必須注意定期沖洗維護(hù)。夏季宜每 乃屬正?，F(xiàn)尤其高溫季節(jié)。器皿及實(shí)驗(yàn)用具，應(yīng)嚴(yán)格滅菌，有的實(shí)驗(yàn)～設(shè)備停運(yùn)時(shí)間超過(guò)天開(kāi)機(jī)沖洗一次。若每隔半小時(shí)以上啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，還要求沒(méi)有核酸酶的污染，故應(yīng)將實(shí)驗(yàn)器械，試劑等進(jìn)行高壓消毒。對(duì)于經(jīng)過(guò)導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理。大批實(shí)驗(yàn)物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進(jìn)行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)的操作，都應(yīng)在紫外線消毒后的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。下面介紹立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（LDZX40BI）的使用方法。（1）開(kāi)蓋：轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使鍋蓋離開(kāi)密封圈。（2）通電：連接自動(dòng)進(jìn)水裝置。接通電源，將控制面板上電源開(kāi)關(guān)按至低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)；缺水（（3）加水：打開(kāi)水源，水位達(dá)到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過(guò)包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。（6）設(shè)定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設(shè)定溫度和時(shí)間。先按控制面板上確認(rèn)鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)。按一次移位鍵指相應(yīng)位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行（單項(xiàng)循環(huán)）移位。按△增加鍵或所需溫度設(shè)定。設(shè)定完畢，按二次確認(rèn)鍵，進(jìn)行溫度確認(rèn)。（7）設(shè)定時(shí)間：按一次確認(rèn)鍵，將溫度設(shè)定切換成時(shí)間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，完畢，按二次確認(rèn)鍵，定時(shí)器開(kāi)始倒計(jì)時(shí)。（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開(kāi)至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時(shí)，壓力表顯示指示為的15%為宜。安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動(dòng)泄壓，并開(kāi)始計(jì)數(shù)滅菌所需時(shí)間。滅菌完成，電控裝置將自動(dòng)關(guān)閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時(shí)間切換成控制面板上電源開(kāi)關(guān)按至（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開(kāi)放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行移位；進(jìn)行時(shí)間設(shè)定確認(rèn)?！鏁r(shí)，將下排汽閥推向水平關(guān)閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量使用最高滅菌溫度為OFF HIGH）綠燈亮，自動(dòng)停止加水。按增加鍵或減少鍵，時(shí)間采用倒計(jì)時(shí)，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。200mm100mm100mm為宜，各所??減少鍵，進(jìn)行 進(jìn)行所需時(shí)間設(shè)定。設(shè)定當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度，～；此時(shí)，將100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。（10）將蓋開(kāi)啟，取出已滅菌物品。關(guān)閉水源，打開(kāi)下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。（1）堆放滅菌物品時(shí)，嚴(yán)禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。（2）滅菌液體時(shí)，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過(guò)選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。（3）對(duì)不同類(lèi)型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA一、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌質(zhì)粒是一類(lèi)雙鏈、閉環(huán)的在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。DNA，大小范圍從在滅菌液體結(jié)束時(shí)不準(zhǔn)立即釋 至200kb3/4體積為好，瓶口隨著染色體的復(fù)特別注意，的提?。瓑A裂解法1kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類(lèi)型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離質(zhì)粒DNA。，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤(pán)繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。，因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來(lái)構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。二、儀器及試劑：37℃恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、50 ml離心管、 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。：LB培養(yǎng)液的配制：酵母浸提物 g；胰蛋白胨 g；NaCl g；依次稱(chēng)量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（ ml）。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTrisHCl（）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖配制：1000 mlmol/L TrisHCl（）ml mol/L EDTA（）ml20% Glucose（）mldH2O910ml將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS配制： 500 ml10% SDSml2N NaOHml取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時(shí)間最好不超過(guò)一個(gè)月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢?。溶?III(醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 。5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸鉀g冰醋酸 ml加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至高溫高壓滅菌后，4℃保存。10TE緩沖液（pH ）：100 mmol/L TrisHCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml mol/LTrisHCl 緩沖液(pH )100ml500 mmol/L EDTA()ml加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml TrisHCl（）平衡苯酚，加入 13500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。其它試劑：TE（）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無(wú)水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）三、操作步驟(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一單菌落，并保持通氣良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)(2） ml，轉(zhuǎn)入棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。（堿裂解法）（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細(xì)菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，液變透明，粘稠）。（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺(tái)式離心機(jī)在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒四、常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時(shí)間過(guò)短；離心時(shí)間或速度不夠。：操作過(guò)程中用力過(guò)猛，動(dòng)作過(guò)大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過(guò)夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。的離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一