pcv2-orf-表達(編輯修改稿)
2024-08-31 08:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 像儀中觀察結(jié)果。 PCR的回收在l％的瓊脂糖凝膠上電泳完P(guān)CR產(chǎn)物后，將膠置于紫外燈下，迅速切下含DNA的瓊脂糖塊，使膠塊盡可能小，：按每100mg瓊脂糖加入300181。L SL液的比例加入SL液，置50℃水浴10min，使瓊脂塊完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次；將溶化后的瓊脂糖移入吸附柱，12000rpm，離心30s，棄去收集管中的液體，在吸附柱中加入500181。L W1液，12000rpm，離心15s，棄去收集管中的液體，再次加入500181。L W1液，靜置lmin，12000rpm，離心15s，棄去收集管中的液體后，將吸附柱放入同一個收集管中，12000rpm，離心l ，在吸附膜中央加入30181。L TI液靜置l min，離心l min，將回收的DNA溶液儲存于20℃?zhèn)溆谩? 目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化將純化回收的目的片段與載體pMD18連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。pMD18T Vector l 181。L回收純化的目的DNA 4 181。LBuffer 5181。L共10181。L反應(yīng)體系，混勻，4℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，第二天對生長的單個茵落進行PCR和酶切鑒定。 感受態(tài)細胞的制備 a 從20℃ 冰柜中取出凍存的菌種，在LB培養(yǎng)基平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)；b 從37℃過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落，接種到3mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；c 取30181。L菌液接種于3mL ；d 無菌條件下，將細菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入滅菌的預(yù)冷的Eppendorf管中，冰浴l0mim；e 4℃下12000r/min離心l min，收集菌體，用l mL ，冰浴30min；f 4℃下12000r/min離心1 min棄上清，4℃放置備用。 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a 取15181。L連接產(chǎn)物加入100181。L感受態(tài)細胞中，冰浴30min；b 快速轉(zhuǎn)移至42℃水浴中熱激90s，立即冰浴3min；c 加入600181。L LB培養(yǎng)基，37℃溫和振蕩45 min， 12000r/min離心 1 min，無菌棄上清，用100181。L LB液體培養(yǎng)基重新懸浮。d 涂平板，將培養(yǎng)物均勻涂布于含Amp的LB平板上，將涂好的平皿放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，再倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。6. 重組質(zhì)粒pET32aORF2的構(gòu)建 目的片段與pET32a表達載體的雙酶切及回收將純化回收PCR產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒分別用BamH I、Hind III雙酶切，37℃酶切過夜。酶切反應(yīng)體系和條件如下：BamH I 5181。LHind III 5181。L10 K Buffer 10181。LPET32a酶切質(zhì)粒 80181。L共l00181。L反應(yīng)體系，37℃過夜酶切。切下所需的目的條帶，PCVORFs切下約531bp，PET32a切下約5100多的大片段。用凝膠回收試劑盒進行純化回收，并用l％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收結(jié)果。 目的片段與表達載體的連接及轉(zhuǎn)化 連接將回收純化的PCV和pET32a片段16℃連接過夜。反應(yīng)體系和
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